اسپکتروفلوریمتری Spectroflourimetry
روشهاي مختلفي كه يك مولكول مي تواند انرژي بدست آمده در اثر جذب را رها
نمايد بررسي مي كنند.
وقتي دفع انرژي به صورت انتشار امواج و در جهات مختلف صورت گيرد اين پديده
را فتولومينانس مي گويند كه دو پديده مهم در فتولومينانس، فسفرسانس و
فلورسانس است. كه اين دو پديده را از اندازه گيري مدت زمان حالت برانگيخته
شد نشان می شناسند، كه پديده فسفرسانس بيشتر از فلورسانس مي باشد.
اما از نظر تجزيه فلورسانس مهمتر از فسفرسانس بوده و تاييد بيشتري خواهد
شد. به كمك اندازه گيري شدت فلورسانس غلظت هاي بسيار كم از اجسام
آلي و معدني را مي توان اندازه گرفت. اگر زمان نشر نور بين5-10 تا 8-10 ثانيه،
باشد فلورسانس و اگر از 4-10 ثانيه بيشتر باشد فسفرسانس مي گويند،
حساسيت روش فلورسانس بيشتر از روش جذبي است و مي توان غلظت
هاي بسيار كم حدود ppm (چند قسمت در ميليون) يا 10/1 ppm را اندازه
گرفت ولي كاربرد فلوريمتر كمتر از روشهاي جذبي است چون اجسامي كه
قادر به توليد فلورسانس باشند كم هستند.
از دو پديده فلورسانس و فسفرسانس در تجربه كمي و كيفي استفاده ميكنند
كه استفاده فلورسانس در روش كمي بيشتر است. فلورسانس با غلظت های
بسيار كم (مقادير جزئي از غلظت رابطه خطي دارد). كاربرد دارد لذا می توانيم
براي تعيين غلظت استفاده كنيم. (FµC).
در فلورسانس وقتي منبع نور را خاموش مي كنيم، نشر نور از جسم قطع مي
شود ولي در فسفرسانس بعد از خاموش كردن منبع هنوز هم جسم نور ساطع
مي كند از نظر دقت روش، دقت فلورسانس خيلي بيشتر از UV است ولي كاربرد
آن كمتر از اسپكتروسكوپي ماوراء بنفش است.
زيرا تعداد داروهاي داراي فلورسانس خيلي كم است. تنها بعضي داروها مثل
بربرين (آلكالوييد زرشك) مورفين و... فلورسانس دارند. در حالي كه اكثر داروها
جذب UV دارند. در بعضي مواقع مي توان براي موادي كه خود فلورسانس ندارند،
از آنها مشتقي تهيه كرد و بعد فلورسانس آن مشتق را اندازه گيري كرد.
عمر لامپ در اينجا مهم است، هر چه لامپ مستهلك تر شود شدت فلورسانس
كمتر مي شود. در صورتي كه در UV عمر لامپ زياد مهم نيست.
کل مولکولهای برانگيخته شده
/تعدادمولکولهای برانگيخته ای که ايجاد نور میکنند
=راندمان فلورسانس
كه اين نسبت بين 1-0 تغيير مي كند.
هر چه شدت فلورسانس كمتر شود اين نسبت به صفر نزديكتر مي شود. از
نظر كيفي:
مي گوئيم در شرايط ثابت طول موج Ex و EM هر جسم ثابت است. هر ماده
يك طول موج تحريكي به نام Ex و يك طول موج نشري بنام EM دارد. كه در
شرايط ثابت براي هر جسم مشخص است.
اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه فلوريمتری
1- منبع نور: لامپ مورد استفاده بايد طول موجهاي يكنواخت در ناحيهUV-Vis
ايجاد كند. كه معمولا از لامپ گزنون استفاده مي كنند كه طول موج هاي
600-200 نانومتر را ايجاد مي كند. شدت فلورسانس بستگي به شدت نور
تابيده شده دارد، پس هر چه لامپ مستهلك تر شود شدت فلورسانس كمتر
مي شود. براي اين منظور از يك تايمر استفاده مي كنند كه عمر لامپ را
نشان مي دهد كه با گذشت 500 ساعت از عمر لامپ آن را تعويض ميكنيم.
2- منوكروماتور اوليه، است كه نور تابيده شده از منبع را تك رنگ مي كند.
بعد از عبور از منوكروماتور اوليه جسم را در يك طول موج خاص تحريك مي كند.
3- سل نمونه: از جنس كوارتز است و نبايد ايجاد فلورسانس كند. چهار طرف
سل شفاف است. و در محل تقاطع دو محور قرار دارد.
4- منوكروماتور ثانويه: كه براي منوكروماتيك كردن نور فلورسانس است و عمود
بر منوكروماتور اوليه است و طول موج EM را از خود عبور مي دهد
(منوكروماتورها از نوع گريتينگ هستند) كه طول موج بالاتر و از انرژي كمتري از
EX دارد.
5- دتكتور: كه براي اندازه گيري شدت نور فلورسانس است و براي جلوگيري از
تداخل، ردياب را هم عمود بر مسير نور اوليه قرار مي دهند. ردياب، يا دتكتور يا
فتوسل معمولا از نوع فتومولتي پلاير است.
6- ثبات (ركوردر): گالوانومتر، يا شكل ديژيتال كه آخرين قسمت دستگاه است.
و جريان را ثبت مي كند و طيف فلورسانس جسم را رسم مي كند.
فلوريمتری
هدف: تعيين مقدار سولفات کينيدين با فلوريمتری
آزمايش: محلول Stock از سولفات كينيدين به غلظت mg/ml 10 موجود است
كه با اسيد سولفوريك N1/0 به حجم رسيده است، از آن غلظت هاي 0.1, 0.3,
0.5, 0.7, 0.9 mg/ml تهيه كرده و براي هر غلظت درصد فلورسانس را توسط
دستگاه بدست مي آوريد، حال اگر يك غلظت مجهول داشته باشيد با بدست
آوردن درصد فلورسانس آن، غلظت مجهول را حساب مي كنيم. منحني F ،C
در غلظت كم خطي مي شود. كه آن را رسم كرده و غلظت مجهول را گزارش
مي دهيم. محور عمودي درصد فلورسانس است و محور افقي غلظت ها كه
برحسب mg/ml نوشته ميشوند.
طرز كار با دستگاه:
دستگاهي كه كار مي كنيم كامپيوتري است دو طول موج داريم، ابتدا Ex را در
250nm ثابت و به EM در محدوده 250-700nm،range ميدهيم. و منحني شدت
فلورسانس برحسب lEM را رسم مي كنيم. در مرحله بعد برعكس عمل ميكنيم.
و بعد از پيداكردن EM، آن را ثابت نگهداشته و به Ex رنج مي دهيم، تا ثابت شود
كه Ex داده شده درست است. اگر Ex داده شده كه 250nm است. درست نبود
به Ex اوليه 50nm اضافه مي كنيم و عمل را دوباره تكرار مي كنيم. تا Ex مورد
نظر درست بدست آيد.
پس اول nm250 = Ex l را ثابت داده و به EMl دامنه مي دهيم. از 250-700nm،
منحني برحسب EM رسم مي شود.
كه در محور عمودي درصد فلورسانس نوشته مي شود.
مثلا Ex l ، 450nm مي شود. كه حداكثر EM است. در مرحله بعد براي اثبات كار
ثابت EM l را گرفته يعني nm 450 = EM l و به Ex l دامنه مي دهيم (nm (450-200،
اگر منحني دوم ثابت كرد كه Ex l داده شد. اوليه كه 250 nm بود درست است كه
هيچي و كار درست انجام شده است وگرنه Ex l اوليه را اضافه كرده عمل را تكرار
مي كنيم. تا منحني دوم ثابت شود. و منحني دوم براي اثبات كار (يعني درست
دادن Ex l اوليه است.
)
منحني دوم برحسب Ex l رسم مي شود. محور افقي برحسب متغير رسم ميشود.
چون در اثر برگشت الكترون به تراز يا مدار پائين تر مقداري اتلاف انرژي داريم. بنابر
اين طول موج Ex l كه مربوط به ناحيه UV است به طول موج بالاتر يعني مرئي ياVis
تبديل مي شود كه همان نور فلورسانس است. بنابراين احتياج نيست كه به دامنه
بيشتر از طول موج EM l داده شود. در طول موج انتخابي محلول حلال يا بلانك نبايد
جذب داشته باشد. بنابراين در منحني اول، حلال را امتحان كرده كه در EM l بدست
آمده جذب نداشته باشد و اگر داشته باشد در اين ناحيه نباشد و يا جزئي باشد
و الا بايد قبل از كار، جذب آن را صفر كرد و از بين برد.
علاقه مندی ها (Bookmarks)