سید لفته فردزاده
4th August 2015, 11:22 AM
از مهمترین روشهای نشاندار کردن DNA میتوان به شروع تصادفی (Random - Primed Labeling)، درزگیری (Nick Translation) و سنتز پروب بکمک PCR اشاره کرد. در nick translation نوکلئوئیدهای نشاندار نشده با نوکلئوئیدهای نشاندار شده تعویض میشوند (سنتزجابجایی). در دو رو ش دیگر منجربه سنتز DNA جدید می شود (Net synthesis).
Random - primed labeling
در هیبریدیزاسیون علاوه بر استفاده از پروب های نشاندار شده با رادیوایزوتوپها ازگروههای تغییر یافته غیر رادیواکتییو مانند بیوتین یادیگوکسی ژنین نیز استفاده میشود .این رو ش در سال 1984 و 1983توسط Feinberg و Vogelstein ابداع گردید .نشاندارکردن توسط آنزیم klenow انجام میشود که قطعه بزرگ DNA پلمیراز I اشرشیاکلی میباشد. Klenow فاقد فعالیت اگزونوکلئازی 5` 3` میباشد ولی برعکس دارای فعالیت اگزونوکلئازی 3` 5` میباشد. برای نشاندار کردن با روش Random - Priming اول DNA دو رشته‌ای )خطی( توسط حرارت دناتوره شده و سپس روی یخ سرد میشود تامانع رناتوراسیون DNA شده ویصورت زنجیره ها ی تک رشته ای باقی بماند. Supercoiled DNA مقدار کمتری نشاندار میشود چون Reannealing رشته هاسریعتر انجام میشود.بنا براین مولکولهای DNA حلقوی باید قبل از نشاندار شدن بصورت خطی درآمده باشند تا عمل Labeling به مقدار زیاد انجام گیرد.از قطعات کوچک DNA هگزا نوکلئوتیدی با توالیهای‌متفاوت به عنوان پرایمر(آغازگر (برای سنتز DNAبکمک یک آنزیم DNA پلیمراز استفاده‌میشود .مخلوط هگزانوکلئوتیدهابه روش تصادفی – اتفاقی به DNA دناتوره شده هدف Anneal میشوند. این الیگونوکلئوتیدهادر واکنش پلیمرازبعدی به عنوانprimer عمل میکنند. سنتز پروب با اضافه کردن آنزیم پلیمراز klenow و چهاردزوکسی نوکلئوتید تری فسفات(که حداقل یکی ازآنها (dUTP) باهاپتن نشاندارشده است) شروع میشود .چون پرایمرها خاصیت تصادفی - اتفاقی دارند میتوانند به همه ترادف های هدف ا تصال یابند . در اثنای سنتزبه روش Random - primed هر دو زنجیره DNA )رشته‌های مکمل DNA هدف (بعد از دناتوراسیون به عنوان الگو عمل میکنند .غلظت زیا'د پرایمر مانع Reanealing دورشته الگو با یکدیگر میشود.در این روش به علت عمل پرایمرهای کوتاه معمولا" رشته DNA نشاندار کوتاهتر از DNA الگو می باشد .چون هر دو رشته DNA اصلی به عنوان Template عمل میکنند رشته های پروب نشاندار نیز تا اندازه‌ای مکمل یکدیگر هستند، بطوری که قبل از هیبریدیزاسیون لازم است دناتوره شوند.از روش Random - primedبرای نشاندار کردن قطعات DNA به مقدار چند نانوگرم تا چندین میکروگرم استفاده میشود .نشاندار شدن بعداز 30ـ60 دقیقه به حداکثر میرسد و هنگام انکوباسیون طولانی ورود ماده نشاندا ر به رشته ثابت است . حساسیت ها’پتن‌هایی مانند بیوتین و Digoxigeninاز طریق Random priming تا 100فمتوگرم DNA مبباشد.
Nick translation
این روش اولین با ربرای نشاندار کردن پروب با را دیوایزوتوپ توسط Rigny در سال 1977 ابداع گردید. در این روش عمل دو آنزیم DNase I و DNA polymerase I اشرشیاکلی روی DNAدو رشته‌ای همزمان‌انجام میگیرد. DNase I یک اندونوکلئاز اختصاصی هیدرولیز کننده باند های فسفودی استر رشته های DNA میباشد. این عمل منجربه ایجاد الیگونوکلئوتیدهای کوتاه حاوی 5` فسفات میشود. عمل آنزیم روی هر رشته DNA مستقیما و در حضور یون Mg2+انجام میگیرد و شکافهایی در DNAیک رشته‌ای بوچود می آورد که تعداد آنها به غلظت Dnase Iدر مخلوط انکوباسیو ن بستگی دارد.این عمل با غلظت پایین Dnase I هم انجام میشود . در این شرایط فقط-تعداد کمی Nick در هر زنجیر DNA به وجود میآید .آنزیم DNA Polymerase I دارای سه فعا'لیت کاتا'لیتیک مستقل یعنی پلیمرازی 5` 3®` , اگزونوکلئازی 5`3® ` واگزونوکلئازی 3`® 5` میباشد..فعالیت نوکلئاز ی 5` 3®` آنزیم باعث حذف دزوکسی نوکلئوتیدها از انتهای 5` فسفات میشود، با فعالیت پلیمرازی 5` 3® ` آن ، آنزیم مذکوربطور همزمان نوکلئوتیدتری فسفاتها را به انتهای 3`-OH آ زاد شکاف (Nick) ا'ضافه میکند .اگر دزکسی نوکلئوتید تری فسفات های همراه دزوکسی نوکلئوتیدتری فسفاتهای‌تغییر یافته با ها'پتن در مخلوط واکنش با شند در اثنای واکنش پلیمریزاسیون هاپتن وارد زنجیره میشود .چون عمل DNA Polymerase I وابسته به DNA الگو است ترادف نوکلئوتیدی هنگام Nick translation بدون تغییربا قی میماند.
نشاندار کردن DNA توسط PCR
PCRیک روش توانمند برای سنتز پروبهای DNA ( DNA بدون وکتور (می'باشد این روش در سال1984توسط مولیس ابداع گردید وبرای کارهایی مانند تکثیر, , Cloning Sequencingو سنتز پروب بکار گرفته شد .در این روش دو پرایمرحاوی دزوکسی نوکلئوتیدتری فسفاتهای نشاندار شده درپلیمریزاسیون DNA شرکت میکنند PCR .توسط یک DNA پلیمراز گرمادوست-مانند Taq انجام میشود .واکنش Amplification در30 سیکل حرارتی در سه مرحله دناتوراسیون، Annealingو Extenssion انجام میگیرد.
هیبریدیزاسیونHybridization
DNAدو رشته‌ای محلول تحت تاثیر حرار ت دناتوره میشود .اگر حرار ت در حدTm مولکول DNA باشد دناتوراسیون برگشت ناپذیر است یعنی رشته‌هایDNA در محیط سرما جدا از یکدیگر باقی میمانند Tm .یک مولکول DNA دو رشته‌ای ایستایی DNA در حرارت می'باشد .(Function of the Thermal Stability) در یک DNA هومولوگ این پدیده انعکاس نسبت با زها یعنی محتوای G+C موجود در DNA میباشد. Cو Gبا سه اتصال هیدروژنی بهم متصل میشوند در حالیکه Tو A با دو اتصال بهم مربوط میشوند Tm .مولکولDNA تحت تاثیر قدرت یونی محیط (با افزایش یونهاTm بالا میرود(، حضور یونها(Mg+) ، پلی ساکاریدها, پرتئین و حلالهای آلی (Formamide) قرار میگیرد .رشته‌های DNA دو رشته‌ای دناتوره شده در حرار ت کمتر از Tm خودبخودبهم چسبیده و نهایتابا DNA مکمل خود یک هیبرید پایدارتشکیل میدهند بنا بر این واکنش از کینتیک ثانوی (Second- Order Kinetics) تبعیت میکند. هیبریدیزاسیون نیز شبیه Tm تحت تاثیر فاکتورهایی مانند قدرت یونی و حلالهای آلی قرار میگیرد. اصطلاح Stringency در این مورد مفهوم مهمی است اما همه این فا'کتورها )حرارت ، غلظت نمک، وجود حلالهای آلی( را دربرنمیگیرد .در شرایط Stringency پایین )نمک زیاد و حرارت کمDNA ( های با شباهت کمتر با همدیگر هیبرید میشوند .در صورتیکه درStringency بالا) غلظت کم نمک و حرارت بالا در حضور فرمامید( Hybridization فقط بین دو DNA باهومولوژی با لا اتفاق میافتد .در این شرایط حرارت Hybridization30ـ20 درجه پایین تر از (melting temprature) tm است .برای انجام Hybridizationباید DNA هدف را روی یک پشتیان جامد منتقل نمود تا DNA نشاندار (بصورت محلول) با DNA هدف هیبرید تشکیل دهند .در ساترن بلات DNA یا RNA روی ژل آگارز الکتروفورز میشوند و سپس روی غشای نیتروسلولزیا نایلونی منتقل میگردند .از مواد پشتیان کننده دیگر مانند سلولز فعال، سفاکریل، پلی استیرن یا بیدهای مگنیتک نیز میتوان استفاده نمود.
پارامترهایHybridization
پایداری هیبرید:
تشکیل هیبریدهای اسیدنوکلئیک یک پروسه برگشت پذیر است . Tm عبارت است از حرارتی که نصف مولکولهای DNA دوپلکس‌به تک رشته تبدیل میشوند و تحت تاثیرغلظت نمک کاتیونهای یک ظرفیتی) مول بر لیتر (تعداد نوکلئوتیدهای زنجیره، ترکیب'بازها ( که با G+C بیان میشود (و غلظت عوامل ناپایدار کننده هلیکس مانند Formamideقرار میگیرد.
کینتیک هیبریدیزاسیون پروبهای تک رشته‌ای: (Riboprobe)
میزان تشکیل هیبرید برای پروبهای تک رشته‌ای از کینتیک اولیه (First - Order Kinetics)تبعیت میکند زیرا تقریبا همیشه غلظت پروب بیشتر از Target DNAاست ، بالاترین میزان هیبریدیزاسیون در محلول بصورت تجربی مشخص میشود. درجه Tm در دو پلکس DNA- DNA 15 درجه کمتر از دوپلکسRNA-DNA است. غلظت کاتیون (M) تاثیر کمتری روی میزان (Constant rate) ثابت هیبریدیزاسیون DNA-DNAدارد .میزان هیبریدیزاسیون تحت ثیر قدر ت یونی پایین قرار میگیرد. هیبریدیزاسیون در 1M NaCl هفت برابربیشتر از 0.18M NaCl انجام میگیرد .کاهش غلظت نمک در حد 0.09M NaCl تا 5 برابر میزان هیبریدیزاسیون را کاهش میدهد. تا ثیر نمک روی تشکیل دوپلکس RNA- DNA تا اندازه‌ای با آنچه ذکر شد اختلاف دارد .در 0.1M NaC تشکیل DNA-RNA همسنگ DNA-DNA (Equivalent) است ولی در 1M NaCl میزان تشکیل دوبلکس RNA-DNA دوبرابر 0.18M است.
کینیک هیبریدیزاسیون در پروبهای دو رشته‌ای (DNA)
در پروبهای دو رشته‌ای هیبریدیزاسیون از کینتیک ثانویه (Second - Order Kinetics)تبعیت میکند. این پروبهامی توانند بااسیدهای نوکلئیک ثابت شده روی فیلتر هیبرید شوند و یادر محلول دوباره Renature گردند. در نتیجه هیبریدیزاسیون 5 برابر آهسته تر از پروبهای تک رشته‌ای انجام میگیرد. پلیمرهای دکستران آنیونی) دکستران سولفات 500) یاپلی اتیلن گلیکول 6000 اتصال دو رشته پرو ب را در محلول به همدیگرتشدید میکنند .دکستران سولفات محلول را از DNA خارج میکند بنا براین غلظت موثر DNA افزایش مییابد .اثر دکستران سولفات برای پلی نوکلئوئیدهای بیشتر از250bp مشهودتر است و روی الیگونوکلئوئیدها تاثیری ندارد. وقتی از پروبهای تک رشته ای استفاده میشودهیبریدیزاسیون تا سه برابر افزایش میابدو وقتی از Nick translated probe استفاده شود تا 100برابر میشود .مولکول‌هایی که از طریق Nick translation نشاندار شده‌اند دکستران سولفات تشکیل شبکه پروب (probe network)یا hyper polymer هاراتسریع نمیکند وتاکید میشود که تشکیل چنین شبکه‌هایی به اندازه پرو ب بستگی دارد. خاطر نشان میسازد که اگر دکستران سولفات در محیط نباشدbackground های غیراختصاصی زیاد میشوند.
روش کار:
Labeling ( نشاندار کردن DNA و RNA )
برای نشاندار کردن قطعه DNA ( پروب) از کیتRandom Primed DNA Labeling شرکت Roch Molecular Biochemicals که با سیستم Digoxigenin (غیر رادیواکتیو) کار میکند استفاده میشود. دیگوکسی ژنین یک هاپتن استروئیدی است کهDNA ، RNAو الیگونوکلئوئیدها را جهتHybridization نشاندار میکند. و ظهور(Detection) آن بصورت کالریمتری انجام میشود. برای نشاندار کردنDNA ، دیگوکسی ژنین از طریق اتصال استری وارد dUTP میشود، اتصال فوق دربرابر قلیا (alkali) ناپایداربوده و این یک امتیازی است که DIG - 11 - dUTP به آسانی توسط قلیااز رشته مکمل روی Filter ( کاغذ نیتروسلولز یا غشا’ نایلون) شسته شده و میتوان دوباره از فیلتربرای هیبریدیزاسیون با پرو ب دیگر استفاده نمود.
ـ DNA را مد ت 10 دقیقه در آ بجو ش قرار داده دهید تا به Single strand DNA تبدیل شودوبلافاصله‌ان را روی یخ حاوی نمک منتقل کنید و مواد زیررا به آن اضافه نمایید.
ـ 2 میکرولیتر ازمخلوط هگزانوکلئوئیدها
- 2 میکرولیتر مخلوط.dNTP
- آب مقطر تا حجم 19 میکرولیتر
- 1 میکرولیتر آنزیم klenow
با دست به ته لوله ضربه بزنیدتا مواد داخل لوله مخلوط شوندو مختصری سانتریفوژکنید (quick spin)
- مد ت 24 ساعت (O/N) در 37 درجه قراردهید.
- واکنش رابا EDTA متوقف کرده وبرای پرسیپیتاسیون Licl با غلظت نهائی 0.5 M به آن اضافه کنید
-رسوب حاصل را در 50 میکرولیتر بافر TE حل کنید.
ـ برای کنترل Labeling یک واکنش نیزبا DNA کنترل موجود در کیت انجام دهید.
بررسی کمی و کیفی پروب نشاندار شده:
از پروب نشاندار شده رقت سریال( 10/1, 100/1, 1000/1) تهیه کنید ( به هر یک از ویال‌ها 9 میکرولیتر آب اضافه کرده سپس یک میکرولیتر از پروب به لوله اول اضافه کرده و خوب مخلوط کنید و همینطور یک میکرولیتر از لوله اول به لوله دوم منتقل کنیدو……..) با انجام Dot blotروی نایلون یا نیتروسلولز آنهارا ظاهر (detect) کنید.
- پس از انجام (dot) لکه‌گذاری قبل از اینکه لکه‌ها'کاملا خشک شوند توسطUV Crosslinker ( مقدار 12000 ژول انرژی) آنها را روی غشا ثابت کنید ( وقتی DNA در معرض UV قرار گیرد تیمین موجود در آن با گروههای آمین روی سطح نایلون cross-link میشوند .
- نایلون را مدت 10 دقیقه دربا فر I قرار دهید. غشا را مدت 1 ساعت دربا فر II قرار دهید تا فیلتر block شود( جاهائیکه DNA وجود ندارد توسط BSA پوشیده (block) میشود تا آنتی بادی نتواند روی غشا بچسبد)
- غشا را مدت 20 دقیقه در Anti Dig بارقت 5000/1 قرار دهید.
- غشا را چند دفعه با بافر I شستشو داده تا آنتی با دی‌های متصل نشده از روی فیلتر حذف شوند.
- غشا را بابافر III شستشو دهید
- لکه‌های روی غشا را با (Nitro Blue Tetrazolium (NBT و (Bromo Chloro Indolyl Phosphate (BCIP ظاهر کنید
ـ با مقایسه رنگ لکه‌ها بارنگ لکه DNA کنترل نشاندار شده موجود در کیت مقدار پروب نشاندار شده را محاسبه کنید). هر میکروگرم DNA کنترل حاوی ... نانوگرم DNA نشاندار شده میباشد.
تهیه Riboprobe
ریبوپروب هااز رونویسی اختصاصی یکی از پروموتورهایT7 ، T3 یا SP6 که در نزدیک DNA کلون شده در یک Vector مناسب قرار دارند تهیه میشوند. معمولا از پلاسمید Bluescriptکه پروموتورهای T3 و T7 در دو طرف MCS آن قرار دارند استفاده میشود(قطعه پروب باید در پلاسمید Bluescript.sk کلون شده باشد).برای‌تهیه Riboprobe پلاسمید نوترکیب را توسط یک Restriction.Enzyme مناسب برش داده تا بصورت خطی دربیآید وبرحسب اینکه قطعه کلون شده در Down stream کدامیک از پروموتورها قرار گرفته باشد پروموتوررا توسط RNA polymerase اختصاصی آن فعال کنید تا از قطعه DNA کلون شده در پلاسمید از طریق RUN off Synthesis در لوله آزمایش RNA سنتز شود.برای تهیه ریبوپروب از کیت (RNA Labeling and Detection Kit)شرکت Roch Molecular Biochemicals استفاده میشود. این کیت از طریق Run Off Synthesisاز DNA معینی که در پلاسمید مخصوصی کلون شده است (الگو) RNA سنتز میکند. به ازای هر25- 20 نوکلئوتید یک مولکول Digoxigenin–11–UTP وارد رشته میشود .چون برای سنتز محدودیتی وجود ندارد مقدار زیادی RNA ساخته میشود .در شرایط استاندارد از هر یک میکروگرم DNA در حدود 10 میکروگرم RNA رونویسی میشود. Riboprobe هایی که با این روش سنتز میشوند دارای خواص زیر هستند:
ـ دارای طول معینی بوده و اختصاصی وتک رشته‌ای می با شند.
شبیه DNA probe ها به یکدیگر متصل نمیشوند.
ـ اتصال Dig به UTP نسبت به NaOH مقاوم میباشد.
رو ش کار:
ـ مقدار 2ـ1 میکروگرم DNA راتوسط Resteriction Enzyne مناسب هضم (digest) کنید.
ـ بعد از اتمام واکنش آن را P.C.I extroction کرده سپس با الکل رسوب دهید.(هرگزازRNase استفاده نکنید).
-2 میکرولیتر NTP به واکنش اضافه کنید.
- 2 میکرولیتر 10X Transcription Buffer به آن‌ا ضافه کنید.
ـ 1 میکرولیتر ((T3, T7) RNA ploymerase به آن اضافه کنید.
- حجم واکنش را با آب مقطربه 20 میکرولیتر برسانید.
-1 میکرولیتر RNasin ( مهار کننده RNase ) به واکنش اضافه کنید تااز فعالیت RNase احتمالی درواکنش جلوگیری کند.
- لوله را مختصری سانتریفیوژ (quick spin) نموده و 2ـ1 ساعت در 37 درجه قرار دهید.
- واکنش رابا EDTA متوقف نموده وبرای رسوب دادن RNA ازLiCl باغلظت نهائی 0.5M استفاده کنید.
- بعد از شستشو با الکل 70، رسوب را در 100 میکرولیترDEPC treated water حل کنید.
- مقدار 1 میکرولیتر RNasin به آن اضافه کرده و 30 دقیقه در 37 درجه انکوبه کنید.
- کمیت پروب تولید شده شبیه DNA probe تعیین میشود فقط برای تهیه بافر II ازDEPC treated water استفاده شود
- از RNA نشاندار شده موجود در کیت برای مقایسه پروبها استفاده کنید.
Hybridization
دراین کارگاه برای هیبرید یزاسیون از دو روش Dot blot hybridization وSouthern blot hybridization استفاده میکنیم.
روش دات بلات
ـ از DNA ( قطعات DNAکلون شده ) رقت سریال تهیه کنید و رویNylon membrane لکه‌گذاری انجام دهید( Dot bloting).
- مدت 5 دقیقه غشانایلونی را در محلول Denaturing قرار دهید تا DNA دناتوره شود.
( لازم به ذکر است که نایلون نباید در محلول شناور شود بلکه باید ته ظرف یا سینی یک لایه کاغذ خشک کن قرار داده شود سپس محلول را روی کاغذ ریخته بطوری که فقط کاغذ خیس شود وسپس نایلون را روی آن قرار دهید.
ـ 5 دقیقه غشارا مانند مرحله قبل در محلول Neutralizing قرار دهید تا.غشا خنثی شده و از شکنندگی آن جلوگیری شود.
- غشا را روی کاغذ خشک کن قرار داده و هنگا میکه هنوز مرطوب است DNA را باUV Cross Linker روی أن ثابت کنید.
ـ غشا در این مرحله آماده است هم میتوان برای مدتی آن را نگهداری نمود و هم میتوان پروسه Hybridization را دنبال نمود.
روش ساترن بلات
DNA را با آنزیم‌های Restriction مناسب هضم کنید و سپس آن راالکتروفورز نمایید. ظرفیت اتصال اسیدهای نوکلئیک به غشا نایلونی 500 میکروگرم در هر سانتیمترمربع میباشد وبرای فیلتر نیتروسلولوز صد میکرو گرم در هر سانتیمتر مربع است .
ـ وقتی الکتروفورز انجام شد ژل رابا UV مشاهده کرده وبرای جلوگیری از اصراف مواد قسمتهائی از ژل را که مورد استفاده نیست حذف کند( ژل را Trim کنید) .
- گوشه( یکی از گوشه‌ها ) ژل را علامت گذاری کرده و سپس 90 دقیقه در حرارت اتاق آن را داخل محلول Denaturing دوران دهید تا DNA دناتوره شود (0.4N NaOH) البته DNA های سنگین تراز15kb را باید با محلول0.25 M اسید کلریدریک Depurinate نمود تا بتوانند از ژل روی غشا منتقل شوند (این کار همراه باshaking انجام شود).
-واکنش را 20 دقیقه در حرارت اتاق در محلول Neutratizing قرار دهید ( همراه باshakingانجام گیرد).
- غشا (Nylon membrane) رابه اندازه ژل بریده و گوشه آن را مانند ژل علامت گذاری کرده و سپس در آب دیونیزه آن را خیس کنید.( 98).
- بعد از آماده کردن تا نک انتقال (Transfer Tank) یک قطعه کاغذ صافی روی سینی تا نک قرار دهید.
- کاغذ صافی را حتما" بابافرتا نک خیس کنید که حباب هوا در آن قرار نگیرد .
- یک لایه کاغذ واتمن3MM روی آن قرار دهید بطوری که دو سر کاغذ دربا فرتا نک قرار گیرد.
- ژل رابصورت وارونه( نسبت به موقعی که الکتروفورز میشود ) روی کاغذ واتمن قرار داده بطوری که زیر ژل حباب هوا قرار نگیرد.
- نایلون آماده شده را روی ژل قرار دهید بطوریکه هوا زیر آن نفوذ نکند.
ـ یک لایه کاغذ واتمن روی فیلتر قرار دهید.
- اطراف آن را با پارافیلم خوب بپوشانید.
ـ یک لایه کاغذ صافی و سپس چندین لایه کاغذ خشک کن روی آن قرار دهید بطوری که مایع را جذب کند.
- یک صفحه شیشه ای روی آن قرار دهیدویک وزنه 500 گرمی روی شیشه مستقرکنید.
- اطراف تا نک را با نایلون بپوشانید که تبا دل هوا با خارج انجام نگیرد واز تبخیربافرتا نک ممانعت نماید.
- برای بافرتا نک از محلول 0.4N NaOH استفاده کنید زیرا برای Nylon بهتر از کاغذ نیتروسلولز میباشدو موجب دناتوره شدن و ثابت شدن DNA روی نایلون میشود.
- مدت 24 ـ4 ساعت در هوای اتاق قرار دهید.
- نایلون را خارج کرده و با 2X SSC بشوئید تا ذرات ژل ازروی آن حذف شوند.
- وقتی نایلون هنوز نمدار است DNA را با دستگاه UV crosslinker روی آن ثابت کنید.
Pre hybridization ( دات بلات یا'ساترن بلات )
ـ غشارا داخل کیسه پلاستیکی (Hybridization bag) قرارداده ومقدار 20ml/100cm2 محلول Prehybridization داخل کیسه ریخته و سپس آن را خوب درز گیری کنید بطوریکه مایع از آن نفوذ نکند( seal شود).
ـ مدت 2- 5/1 ساعت در 42 درجه قراردهید( برای ریبوپروب حرارت 50 درجه درنظرگرفته شود )
ـ پروب را مدت 5 دقیقه درآب جوش قرار داده تا دناتوره شود
- بلافاصله روی یخ حاوی نمک قرار دهید.
ـ یکی از گوشه های کیسه پلاستیکی حاوی nylon را بریده و آن را روی کاغذ خشک‌کن قرار داده و با چرخانیدن یک مداد یا میله شیشه‌ای گرد روی آن , محلول Prehyridization را از آن خارج کنید.
- مقدار 2.5ml/100cm2 پروب مخلوط شده با محلول Hybridization وارد کیسه کنید.
- هوای آن را خارج کرده دوباره آن را seal کنید.
- مدت یک شب آن را در 42 درجه قرار دهید. ( برای ریبوپروب 50.درجه).
Post hybridization
- نایلون را از کیسه خارج کنید.
- مدت 5 دقیقه بامحلول2XSSC , 1% SDS همراه shaking در حرارت اطاق نایلون را بشوئید.
- مدت 15 دقیقه بامحلول 2XSSC , 1% SDS آن را یشوئید (RT)
- مدت 30 دقیقه بامحلول 2XSSC , 1% SDS در65 درجه شستشو دهید.
- Detection آن شبیه پروب انجام میگیرد.
هیبریدیزاسیون با Riboprobe
- مراحل Dot blot یا Southern blot شبیه DNA پروب انجام میگیرد.
ـ دمای Hybridization را 50 درجه درنظربگیرید.
– بهتر است پروب (RNA) را هنگام استفاده مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار دهید تا چنانچه RNAدایره (Loop) تشکیل داده است باز شود.
ـ مراحل شستشو و Detection نیز شبیه DNA انجام میگیرد.
ـ باید دقت نمود که حین پروسه کار Rnase وارد محیط نشود وازتما'س دست یا با وسایل کار و نمونه خودداری شود.
- حتما" از دستکش استفاده کنید
- وسایل شیشه‌ای، تیپها و محلول‌هارا با ید از آلوده شدن با RNase محافظت نمود.
- موادووسایل کاربا RNA باید از وسایل و مواد دیگر جداباشند. وسایل شیشه‌ای بعد از شستشوبا ید در محلول 1/0درصدDEPC شناور شوند و سپس اتوکلاو گردند وبعد از آن‌بمدت 3 ساعت در250 درجه قرار گیرند.
تیپها ، لوله‌های سانتریفیوژ و لوله‌های فالکن فاقد RNase میباشند ولی با یداتوکلاو شوند.
DEPCماده مهار کننده غیر اختصاصی ریبونوکلئاز میباشد که با آدنین موجود درRNA واکنش میدهد.
تهیهDeionized formamide
یکی از مشکلات در Riboprobe hybridization تجزیه شدن RNA توسط آلوده کننده‌ها ی موجود در Formamide میباشد برای جلوگیری از این عمل با ید فرمامید دیونیزه شود.
روش کار:
- برای دیونیزه کردن فرمامید احتیاج به رزین (lonexchanger) میباشد .از کاتیون (Carboxymethyl) و آنیون (Diethylaminoethyl) DEAE استفاده میشود.
- کاتیون و آنیون( از هر کدام 5 گرم) جداگا نه بایک لیترآب Equilibrate میشوند. بعد از مخلوط شدن محلول ابری مانند تشکیل میگردد .این محلول را با دستگاه فیلتراسیون در خلا فیلتر( کاغذ صافی واتمن ) کرده تا آب رزین خارج شده و رزین روی فیلتربا قی بماند و خشک شود سپس با یک لیتر فرمامید 30 دقیقه روی همزن میچرخد تا خوب مخلوط شود .محلول دو باره با دستگاه فیلتراسیون درخلا با کاغذ صافی واتمن فیلتر میشود بطوری که یک محلول صاف تشکیل میگردد.این محلول Deionized Formamideدر یخچال نگهداری میشود.
طرزتهیه بافرها:
الف ) بافرهای Detection (ظهور) :
1- بافرI:
Tris (PH:7.5) 100mM
NaCl 500mM
2- بافرII :
(1-3% BSA (blocking reagent که در بافر I 65درجه حرارت داه میشود تا حل شود
3- بافر III:
Tris (pH:9.5) 100mM
NaCl 100mM
MgCl2 50mM
ب) بافرهای Hybridization :
1- بافر Pre hybridization:
Deionized formamide 50%
SSC 5X
Denhardts 5X
hosphate buffer 50mM
SS DNA 125mg/ml
2- بافر Hybridization :
Deionized formamide 50%
SSC 5X
Denhardts 1X
Phosphat buffer 20mM
SS DNA 25mg/ml
Dextran sulfate 10%
3- محلول Denhardts :
BSA 1%
Ficoll 1%
Polyvinyl pyrolidone 1%
4- با فر 20X SSC :
NaCl 3M
Na Citrate 3M
pH: 7
Random - primed labeling
در هیبریدیزاسیون علاوه بر استفاده از پروب های نشاندار شده با رادیوایزوتوپها ازگروههای تغییر یافته غیر رادیواکتییو مانند بیوتین یادیگوکسی ژنین نیز استفاده میشود .این رو ش در سال 1984 و 1983توسط Feinberg و Vogelstein ابداع گردید .نشاندارکردن توسط آنزیم klenow انجام میشود که قطعه بزرگ DNA پلمیراز I اشرشیاکلی میباشد. Klenow فاقد فعالیت اگزونوکلئازی 5` 3` میباشد ولی برعکس دارای فعالیت اگزونوکلئازی 3` 5` میباشد. برای نشاندار کردن با روش Random - Priming اول DNA دو رشته‌ای )خطی( توسط حرارت دناتوره شده و سپس روی یخ سرد میشود تامانع رناتوراسیون DNA شده ویصورت زنجیره ها ی تک رشته ای باقی بماند. Supercoiled DNA مقدار کمتری نشاندار میشود چون Reannealing رشته هاسریعتر انجام میشود.بنا براین مولکولهای DNA حلقوی باید قبل از نشاندار شدن بصورت خطی درآمده باشند تا عمل Labeling به مقدار زیاد انجام گیرد.از قطعات کوچک DNA هگزا نوکلئوتیدی با توالیهای‌متفاوت به عنوان پرایمر(آغازگر (برای سنتز DNAبکمک یک آنزیم DNA پلیمراز استفاده‌میشود .مخلوط هگزانوکلئوتیدهابه روش تصادفی – اتفاقی به DNA دناتوره شده هدف Anneal میشوند. این الیگونوکلئوتیدهادر واکنش پلیمرازبعدی به عنوانprimer عمل میکنند. سنتز پروب با اضافه کردن آنزیم پلیمراز klenow و چهاردزوکسی نوکلئوتید تری فسفات(که حداقل یکی ازآنها (dUTP) باهاپتن نشاندارشده است) شروع میشود .چون پرایمرها خاصیت تصادفی - اتفاقی دارند میتوانند به همه ترادف های هدف ا تصال یابند . در اثنای سنتزبه روش Random - primed هر دو زنجیره DNA )رشته‌های مکمل DNA هدف (بعد از دناتوراسیون به عنوان الگو عمل میکنند .غلظت زیا'د پرایمر مانع Reanealing دورشته الگو با یکدیگر میشود.در این روش به علت عمل پرایمرهای کوتاه معمولا" رشته DNA نشاندار کوتاهتر از DNA الگو می باشد .چون هر دو رشته DNA اصلی به عنوان Template عمل میکنند رشته های پروب نشاندار نیز تا اندازه‌ای مکمل یکدیگر هستند، بطوری که قبل از هیبریدیزاسیون لازم است دناتوره شوند.از روش Random - primedبرای نشاندار کردن قطعات DNA به مقدار چند نانوگرم تا چندین میکروگرم استفاده میشود .نشاندار شدن بعداز 30ـ60 دقیقه به حداکثر میرسد و هنگام انکوباسیون طولانی ورود ماده نشاندا ر به رشته ثابت است . حساسیت ها’پتن‌هایی مانند بیوتین و Digoxigeninاز طریق Random priming تا 100فمتوگرم DNA مبباشد.
Nick translation
این روش اولین با ربرای نشاندار کردن پروب با را دیوایزوتوپ توسط Rigny در سال 1977 ابداع گردید. در این روش عمل دو آنزیم DNase I و DNA polymerase I اشرشیاکلی روی DNAدو رشته‌ای همزمان‌انجام میگیرد. DNase I یک اندونوکلئاز اختصاصی هیدرولیز کننده باند های فسفودی استر رشته های DNA میباشد. این عمل منجربه ایجاد الیگونوکلئوتیدهای کوتاه حاوی 5` فسفات میشود. عمل آنزیم روی هر رشته DNA مستقیما و در حضور یون Mg2+انجام میگیرد و شکافهایی در DNAیک رشته‌ای بوچود می آورد که تعداد آنها به غلظت Dnase Iدر مخلوط انکوباسیو ن بستگی دارد.این عمل با غلظت پایین Dnase I هم انجام میشود . در این شرایط فقط-تعداد کمی Nick در هر زنجیر DNA به وجود میآید .آنزیم DNA Polymerase I دارای سه فعا'لیت کاتا'لیتیک مستقل یعنی پلیمرازی 5` 3®` , اگزونوکلئازی 5`3® ` واگزونوکلئازی 3`® 5` میباشد..فعالیت نوکلئاز ی 5` 3®` آنزیم باعث حذف دزوکسی نوکلئوتیدها از انتهای 5` فسفات میشود، با فعالیت پلیمرازی 5` 3® ` آن ، آنزیم مذکوربطور همزمان نوکلئوتیدتری فسفاتها را به انتهای 3`-OH آ زاد شکاف (Nick) ا'ضافه میکند .اگر دزکسی نوکلئوتید تری فسفات های همراه دزوکسی نوکلئوتیدتری فسفاتهای‌تغییر یافته با ها'پتن در مخلوط واکنش با شند در اثنای واکنش پلیمریزاسیون هاپتن وارد زنجیره میشود .چون عمل DNA Polymerase I وابسته به DNA الگو است ترادف نوکلئوتیدی هنگام Nick translation بدون تغییربا قی میماند.
نشاندار کردن DNA توسط PCR
PCRیک روش توانمند برای سنتز پروبهای DNA ( DNA بدون وکتور (می'باشد این روش در سال1984توسط مولیس ابداع گردید وبرای کارهایی مانند تکثیر, , Cloning Sequencingو سنتز پروب بکار گرفته شد .در این روش دو پرایمرحاوی دزوکسی نوکلئوتیدتری فسفاتهای نشاندار شده درپلیمریزاسیون DNA شرکت میکنند PCR .توسط یک DNA پلیمراز گرمادوست-مانند Taq انجام میشود .واکنش Amplification در30 سیکل حرارتی در سه مرحله دناتوراسیون، Annealingو Extenssion انجام میگیرد.
هیبریدیزاسیونHybridization
DNAدو رشته‌ای محلول تحت تاثیر حرار ت دناتوره میشود .اگر حرار ت در حدTm مولکول DNA باشد دناتوراسیون برگشت ناپذیر است یعنی رشته‌هایDNA در محیط سرما جدا از یکدیگر باقی میمانند Tm .یک مولکول DNA دو رشته‌ای ایستایی DNA در حرارت می'باشد .(Function of the Thermal Stability) در یک DNA هومولوگ این پدیده انعکاس نسبت با زها یعنی محتوای G+C موجود در DNA میباشد. Cو Gبا سه اتصال هیدروژنی بهم متصل میشوند در حالیکه Tو A با دو اتصال بهم مربوط میشوند Tm .مولکولDNA تحت تاثیر قدرت یونی محیط (با افزایش یونهاTm بالا میرود(، حضور یونها(Mg+) ، پلی ساکاریدها, پرتئین و حلالهای آلی (Formamide) قرار میگیرد .رشته‌های DNA دو رشته‌ای دناتوره شده در حرار ت کمتر از Tm خودبخودبهم چسبیده و نهایتابا DNA مکمل خود یک هیبرید پایدارتشکیل میدهند بنا بر این واکنش از کینتیک ثانوی (Second- Order Kinetics) تبعیت میکند. هیبریدیزاسیون نیز شبیه Tm تحت تاثیر فاکتورهایی مانند قدرت یونی و حلالهای آلی قرار میگیرد. اصطلاح Stringency در این مورد مفهوم مهمی است اما همه این فا'کتورها )حرارت ، غلظت نمک، وجود حلالهای آلی( را دربرنمیگیرد .در شرایط Stringency پایین )نمک زیاد و حرارت کمDNA ( های با شباهت کمتر با همدیگر هیبرید میشوند .در صورتیکه درStringency بالا) غلظت کم نمک و حرارت بالا در حضور فرمامید( Hybridization فقط بین دو DNA باهومولوژی با لا اتفاق میافتد .در این شرایط حرارت Hybridization30ـ20 درجه پایین تر از (melting temprature) tm است .برای انجام Hybridizationباید DNA هدف را روی یک پشتیان جامد منتقل نمود تا DNA نشاندار (بصورت محلول) با DNA هدف هیبرید تشکیل دهند .در ساترن بلات DNA یا RNA روی ژل آگارز الکتروفورز میشوند و سپس روی غشای نیتروسلولزیا نایلونی منتقل میگردند .از مواد پشتیان کننده دیگر مانند سلولز فعال، سفاکریل، پلی استیرن یا بیدهای مگنیتک نیز میتوان استفاده نمود.
پارامترهایHybridization
پایداری هیبرید:
تشکیل هیبریدهای اسیدنوکلئیک یک پروسه برگشت پذیر است . Tm عبارت است از حرارتی که نصف مولکولهای DNA دوپلکس‌به تک رشته تبدیل میشوند و تحت تاثیرغلظت نمک کاتیونهای یک ظرفیتی) مول بر لیتر (تعداد نوکلئوتیدهای زنجیره، ترکیب'بازها ( که با G+C بیان میشود (و غلظت عوامل ناپایدار کننده هلیکس مانند Formamideقرار میگیرد.
کینتیک هیبریدیزاسیون پروبهای تک رشته‌ای: (Riboprobe)
میزان تشکیل هیبرید برای پروبهای تک رشته‌ای از کینتیک اولیه (First - Order Kinetics)تبعیت میکند زیرا تقریبا همیشه غلظت پروب بیشتر از Target DNAاست ، بالاترین میزان هیبریدیزاسیون در محلول بصورت تجربی مشخص میشود. درجه Tm در دو پلکس DNA- DNA 15 درجه کمتر از دوپلکسRNA-DNA است. غلظت کاتیون (M) تاثیر کمتری روی میزان (Constant rate) ثابت هیبریدیزاسیون DNA-DNAدارد .میزان هیبریدیزاسیون تحت ثیر قدر ت یونی پایین قرار میگیرد. هیبریدیزاسیون در 1M NaCl هفت برابربیشتر از 0.18M NaCl انجام میگیرد .کاهش غلظت نمک در حد 0.09M NaCl تا 5 برابر میزان هیبریدیزاسیون را کاهش میدهد. تا ثیر نمک روی تشکیل دوپلکس RNA- DNA تا اندازه‌ای با آنچه ذکر شد اختلاف دارد .در 0.1M NaC تشکیل DNA-RNA همسنگ DNA-DNA (Equivalent) است ولی در 1M NaCl میزان تشکیل دوبلکس RNA-DNA دوبرابر 0.18M است.
کینیک هیبریدیزاسیون در پروبهای دو رشته‌ای (DNA)
در پروبهای دو رشته‌ای هیبریدیزاسیون از کینتیک ثانویه (Second - Order Kinetics)تبعیت میکند. این پروبهامی توانند بااسیدهای نوکلئیک ثابت شده روی فیلتر هیبرید شوند و یادر محلول دوباره Renature گردند. در نتیجه هیبریدیزاسیون 5 برابر آهسته تر از پروبهای تک رشته‌ای انجام میگیرد. پلیمرهای دکستران آنیونی) دکستران سولفات 500) یاپلی اتیلن گلیکول 6000 اتصال دو رشته پرو ب را در محلول به همدیگرتشدید میکنند .دکستران سولفات محلول را از DNA خارج میکند بنا براین غلظت موثر DNA افزایش مییابد .اثر دکستران سولفات برای پلی نوکلئوئیدهای بیشتر از250bp مشهودتر است و روی الیگونوکلئوئیدها تاثیری ندارد. وقتی از پروبهای تک رشته ای استفاده میشودهیبریدیزاسیون تا سه برابر افزایش میابدو وقتی از Nick translated probe استفاده شود تا 100برابر میشود .مولکول‌هایی که از طریق Nick translation نشاندار شده‌اند دکستران سولفات تشکیل شبکه پروب (probe network)یا hyper polymer هاراتسریع نمیکند وتاکید میشود که تشکیل چنین شبکه‌هایی به اندازه پرو ب بستگی دارد. خاطر نشان میسازد که اگر دکستران سولفات در محیط نباشدbackground های غیراختصاصی زیاد میشوند.
روش کار:
Labeling ( نشاندار کردن DNA و RNA )
برای نشاندار کردن قطعه DNA ( پروب) از کیتRandom Primed DNA Labeling شرکت Roch Molecular Biochemicals که با سیستم Digoxigenin (غیر رادیواکتیو) کار میکند استفاده میشود. دیگوکسی ژنین یک هاپتن استروئیدی است کهDNA ، RNAو الیگونوکلئوئیدها را جهتHybridization نشاندار میکند. و ظهور(Detection) آن بصورت کالریمتری انجام میشود. برای نشاندار کردنDNA ، دیگوکسی ژنین از طریق اتصال استری وارد dUTP میشود، اتصال فوق دربرابر قلیا (alkali) ناپایداربوده و این یک امتیازی است که DIG - 11 - dUTP به آسانی توسط قلیااز رشته مکمل روی Filter ( کاغذ نیتروسلولز یا غشا’ نایلون) شسته شده و میتوان دوباره از فیلتربرای هیبریدیزاسیون با پرو ب دیگر استفاده نمود.
ـ DNA را مد ت 10 دقیقه در آ بجو ش قرار داده دهید تا به Single strand DNA تبدیل شودوبلافاصله‌ان را روی یخ حاوی نمک منتقل کنید و مواد زیررا به آن اضافه نمایید.
ـ 2 میکرولیتر ازمخلوط هگزانوکلئوئیدها
- 2 میکرولیتر مخلوط.dNTP
- آب مقطر تا حجم 19 میکرولیتر
- 1 میکرولیتر آنزیم klenow
با دست به ته لوله ضربه بزنیدتا مواد داخل لوله مخلوط شوندو مختصری سانتریفوژکنید (quick spin)
- مد ت 24 ساعت (O/N) در 37 درجه قراردهید.
- واکنش رابا EDTA متوقف کرده وبرای پرسیپیتاسیون Licl با غلظت نهائی 0.5 M به آن اضافه کنید
-رسوب حاصل را در 50 میکرولیتر بافر TE حل کنید.
ـ برای کنترل Labeling یک واکنش نیزبا DNA کنترل موجود در کیت انجام دهید.
بررسی کمی و کیفی پروب نشاندار شده:
از پروب نشاندار شده رقت سریال( 10/1, 100/1, 1000/1) تهیه کنید ( به هر یک از ویال‌ها 9 میکرولیتر آب اضافه کرده سپس یک میکرولیتر از پروب به لوله اول اضافه کرده و خوب مخلوط کنید و همینطور یک میکرولیتر از لوله اول به لوله دوم منتقل کنیدو……..) با انجام Dot blotروی نایلون یا نیتروسلولز آنهارا ظاهر (detect) کنید.
- پس از انجام (dot) لکه‌گذاری قبل از اینکه لکه‌ها'کاملا خشک شوند توسطUV Crosslinker ( مقدار 12000 ژول انرژی) آنها را روی غشا ثابت کنید ( وقتی DNA در معرض UV قرار گیرد تیمین موجود در آن با گروههای آمین روی سطح نایلون cross-link میشوند .
- نایلون را مدت 10 دقیقه دربا فر I قرار دهید. غشا را مدت 1 ساعت دربا فر II قرار دهید تا فیلتر block شود( جاهائیکه DNA وجود ندارد توسط BSA پوشیده (block) میشود تا آنتی بادی نتواند روی غشا بچسبد)
- غشا را مدت 20 دقیقه در Anti Dig بارقت 5000/1 قرار دهید.
- غشا را چند دفعه با بافر I شستشو داده تا آنتی با دی‌های متصل نشده از روی فیلتر حذف شوند.
- غشا را بابافر III شستشو دهید
- لکه‌های روی غشا را با (Nitro Blue Tetrazolium (NBT و (Bromo Chloro Indolyl Phosphate (BCIP ظاهر کنید
ـ با مقایسه رنگ لکه‌ها بارنگ لکه DNA کنترل نشاندار شده موجود در کیت مقدار پروب نشاندار شده را محاسبه کنید). هر میکروگرم DNA کنترل حاوی ... نانوگرم DNA نشاندار شده میباشد.
تهیه Riboprobe
ریبوپروب هااز رونویسی اختصاصی یکی از پروموتورهایT7 ، T3 یا SP6 که در نزدیک DNA کلون شده در یک Vector مناسب قرار دارند تهیه میشوند. معمولا از پلاسمید Bluescriptکه پروموتورهای T3 و T7 در دو طرف MCS آن قرار دارند استفاده میشود(قطعه پروب باید در پلاسمید Bluescript.sk کلون شده باشد).برای‌تهیه Riboprobe پلاسمید نوترکیب را توسط یک Restriction.Enzyme مناسب برش داده تا بصورت خطی دربیآید وبرحسب اینکه قطعه کلون شده در Down stream کدامیک از پروموتورها قرار گرفته باشد پروموتوررا توسط RNA polymerase اختصاصی آن فعال کنید تا از قطعه DNA کلون شده در پلاسمید از طریق RUN off Synthesis در لوله آزمایش RNA سنتز شود.برای تهیه ریبوپروب از کیت (RNA Labeling and Detection Kit)شرکت Roch Molecular Biochemicals استفاده میشود. این کیت از طریق Run Off Synthesisاز DNA معینی که در پلاسمید مخصوصی کلون شده است (الگو) RNA سنتز میکند. به ازای هر25- 20 نوکلئوتید یک مولکول Digoxigenin–11–UTP وارد رشته میشود .چون برای سنتز محدودیتی وجود ندارد مقدار زیادی RNA ساخته میشود .در شرایط استاندارد از هر یک میکروگرم DNA در حدود 10 میکروگرم RNA رونویسی میشود. Riboprobe هایی که با این روش سنتز میشوند دارای خواص زیر هستند:
ـ دارای طول معینی بوده و اختصاصی وتک رشته‌ای می با شند.
شبیه DNA probe ها به یکدیگر متصل نمیشوند.
ـ اتصال Dig به UTP نسبت به NaOH مقاوم میباشد.
رو ش کار:
ـ مقدار 2ـ1 میکروگرم DNA راتوسط Resteriction Enzyne مناسب هضم (digest) کنید.
ـ بعد از اتمام واکنش آن را P.C.I extroction کرده سپس با الکل رسوب دهید.(هرگزازRNase استفاده نکنید).
-2 میکرولیتر NTP به واکنش اضافه کنید.
- 2 میکرولیتر 10X Transcription Buffer به آن‌ا ضافه کنید.
ـ 1 میکرولیتر ((T3, T7) RNA ploymerase به آن اضافه کنید.
- حجم واکنش را با آب مقطربه 20 میکرولیتر برسانید.
-1 میکرولیتر RNasin ( مهار کننده RNase ) به واکنش اضافه کنید تااز فعالیت RNase احتمالی درواکنش جلوگیری کند.
- لوله را مختصری سانتریفیوژ (quick spin) نموده و 2ـ1 ساعت در 37 درجه قرار دهید.
- واکنش رابا EDTA متوقف نموده وبرای رسوب دادن RNA ازLiCl باغلظت نهائی 0.5M استفاده کنید.
- بعد از شستشو با الکل 70، رسوب را در 100 میکرولیترDEPC treated water حل کنید.
- مقدار 1 میکرولیتر RNasin به آن اضافه کرده و 30 دقیقه در 37 درجه انکوبه کنید.
- کمیت پروب تولید شده شبیه DNA probe تعیین میشود فقط برای تهیه بافر II ازDEPC treated water استفاده شود
- از RNA نشاندار شده موجود در کیت برای مقایسه پروبها استفاده کنید.
Hybridization
دراین کارگاه برای هیبرید یزاسیون از دو روش Dot blot hybridization وSouthern blot hybridization استفاده میکنیم.
روش دات بلات
ـ از DNA ( قطعات DNAکلون شده ) رقت سریال تهیه کنید و رویNylon membrane لکه‌گذاری انجام دهید( Dot bloting).
- مدت 5 دقیقه غشانایلونی را در محلول Denaturing قرار دهید تا DNA دناتوره شود.
( لازم به ذکر است که نایلون نباید در محلول شناور شود بلکه باید ته ظرف یا سینی یک لایه کاغذ خشک کن قرار داده شود سپس محلول را روی کاغذ ریخته بطوری که فقط کاغذ خیس شود وسپس نایلون را روی آن قرار دهید.
ـ 5 دقیقه غشارا مانند مرحله قبل در محلول Neutralizing قرار دهید تا.غشا خنثی شده و از شکنندگی آن جلوگیری شود.
- غشا را روی کاغذ خشک کن قرار داده و هنگا میکه هنوز مرطوب است DNA را باUV Cross Linker روی أن ثابت کنید.
ـ غشا در این مرحله آماده است هم میتوان برای مدتی آن را نگهداری نمود و هم میتوان پروسه Hybridization را دنبال نمود.
روش ساترن بلات
DNA را با آنزیم‌های Restriction مناسب هضم کنید و سپس آن راالکتروفورز نمایید. ظرفیت اتصال اسیدهای نوکلئیک به غشا نایلونی 500 میکروگرم در هر سانتیمترمربع میباشد وبرای فیلتر نیتروسلولوز صد میکرو گرم در هر سانتیمتر مربع است .
ـ وقتی الکتروفورز انجام شد ژل رابا UV مشاهده کرده وبرای جلوگیری از اصراف مواد قسمتهائی از ژل را که مورد استفاده نیست حذف کند( ژل را Trim کنید) .
- گوشه( یکی از گوشه‌ها ) ژل را علامت گذاری کرده و سپس 90 دقیقه در حرارت اتاق آن را داخل محلول Denaturing دوران دهید تا DNA دناتوره شود (0.4N NaOH) البته DNA های سنگین تراز15kb را باید با محلول0.25 M اسید کلریدریک Depurinate نمود تا بتوانند از ژل روی غشا منتقل شوند (این کار همراه باshaking انجام شود).
-واکنش را 20 دقیقه در حرارت اتاق در محلول Neutratizing قرار دهید ( همراه باshakingانجام گیرد).
- غشا (Nylon membrane) رابه اندازه ژل بریده و گوشه آن را مانند ژل علامت گذاری کرده و سپس در آب دیونیزه آن را خیس کنید.( 98).
- بعد از آماده کردن تا نک انتقال (Transfer Tank) یک قطعه کاغذ صافی روی سینی تا نک قرار دهید.
- کاغذ صافی را حتما" بابافرتا نک خیس کنید که حباب هوا در آن قرار نگیرد .
- یک لایه کاغذ واتمن3MM روی آن قرار دهید بطوری که دو سر کاغذ دربا فرتا نک قرار گیرد.
- ژل رابصورت وارونه( نسبت به موقعی که الکتروفورز میشود ) روی کاغذ واتمن قرار داده بطوری که زیر ژل حباب هوا قرار نگیرد.
- نایلون آماده شده را روی ژل قرار دهید بطوریکه هوا زیر آن نفوذ نکند.
ـ یک لایه کاغذ واتمن روی فیلتر قرار دهید.
- اطراف آن را با پارافیلم خوب بپوشانید.
ـ یک لایه کاغذ صافی و سپس چندین لایه کاغذ خشک کن روی آن قرار دهید بطوری که مایع را جذب کند.
- یک صفحه شیشه ای روی آن قرار دهیدویک وزنه 500 گرمی روی شیشه مستقرکنید.
- اطراف تا نک را با نایلون بپوشانید که تبا دل هوا با خارج انجام نگیرد واز تبخیربافرتا نک ممانعت نماید.
- برای بافرتا نک از محلول 0.4N NaOH استفاده کنید زیرا برای Nylon بهتر از کاغذ نیتروسلولز میباشدو موجب دناتوره شدن و ثابت شدن DNA روی نایلون میشود.
- مدت 24 ـ4 ساعت در هوای اتاق قرار دهید.
- نایلون را خارج کرده و با 2X SSC بشوئید تا ذرات ژل ازروی آن حذف شوند.
- وقتی نایلون هنوز نمدار است DNA را با دستگاه UV crosslinker روی آن ثابت کنید.
Pre hybridization ( دات بلات یا'ساترن بلات )
ـ غشارا داخل کیسه پلاستیکی (Hybridization bag) قرارداده ومقدار 20ml/100cm2 محلول Prehybridization داخل کیسه ریخته و سپس آن را خوب درز گیری کنید بطوریکه مایع از آن نفوذ نکند( seal شود).
ـ مدت 2- 5/1 ساعت در 42 درجه قراردهید( برای ریبوپروب حرارت 50 درجه درنظرگرفته شود )
ـ پروب را مدت 5 دقیقه درآب جوش قرار داده تا دناتوره شود
- بلافاصله روی یخ حاوی نمک قرار دهید.
ـ یکی از گوشه های کیسه پلاستیکی حاوی nylon را بریده و آن را روی کاغذ خشک‌کن قرار داده و با چرخانیدن یک مداد یا میله شیشه‌ای گرد روی آن , محلول Prehyridization را از آن خارج کنید.
- مقدار 2.5ml/100cm2 پروب مخلوط شده با محلول Hybridization وارد کیسه کنید.
- هوای آن را خارج کرده دوباره آن را seal کنید.
- مدت یک شب آن را در 42 درجه قرار دهید. ( برای ریبوپروب 50.درجه).
Post hybridization
- نایلون را از کیسه خارج کنید.
- مدت 5 دقیقه بامحلول2XSSC , 1% SDS همراه shaking در حرارت اطاق نایلون را بشوئید.
- مدت 15 دقیقه بامحلول 2XSSC , 1% SDS آن را یشوئید (RT)
- مدت 30 دقیقه بامحلول 2XSSC , 1% SDS در65 درجه شستشو دهید.
- Detection آن شبیه پروب انجام میگیرد.
هیبریدیزاسیون با Riboprobe
- مراحل Dot blot یا Southern blot شبیه DNA پروب انجام میگیرد.
ـ دمای Hybridization را 50 درجه درنظربگیرید.
– بهتر است پروب (RNA) را هنگام استفاده مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار دهید تا چنانچه RNAدایره (Loop) تشکیل داده است باز شود.
ـ مراحل شستشو و Detection نیز شبیه DNA انجام میگیرد.
ـ باید دقت نمود که حین پروسه کار Rnase وارد محیط نشود وازتما'س دست یا با وسایل کار و نمونه خودداری شود.
- حتما" از دستکش استفاده کنید
- وسایل شیشه‌ای، تیپها و محلول‌هارا با ید از آلوده شدن با RNase محافظت نمود.
- موادووسایل کاربا RNA باید از وسایل و مواد دیگر جداباشند. وسایل شیشه‌ای بعد از شستشوبا ید در محلول 1/0درصدDEPC شناور شوند و سپس اتوکلاو گردند وبعد از آن‌بمدت 3 ساعت در250 درجه قرار گیرند.
تیپها ، لوله‌های سانتریفیوژ و لوله‌های فالکن فاقد RNase میباشند ولی با یداتوکلاو شوند.
DEPCماده مهار کننده غیر اختصاصی ریبونوکلئاز میباشد که با آدنین موجود درRNA واکنش میدهد.
تهیهDeionized formamide
یکی از مشکلات در Riboprobe hybridization تجزیه شدن RNA توسط آلوده کننده‌ها ی موجود در Formamide میباشد برای جلوگیری از این عمل با ید فرمامید دیونیزه شود.
روش کار:
- برای دیونیزه کردن فرمامید احتیاج به رزین (lonexchanger) میباشد .از کاتیون (Carboxymethyl) و آنیون (Diethylaminoethyl) DEAE استفاده میشود.
- کاتیون و آنیون( از هر کدام 5 گرم) جداگا نه بایک لیترآب Equilibrate میشوند. بعد از مخلوط شدن محلول ابری مانند تشکیل میگردد .این محلول را با دستگاه فیلتراسیون در خلا فیلتر( کاغذ صافی واتمن ) کرده تا آب رزین خارج شده و رزین روی فیلتربا قی بماند و خشک شود سپس با یک لیتر فرمامید 30 دقیقه روی همزن میچرخد تا خوب مخلوط شود .محلول دو باره با دستگاه فیلتراسیون درخلا با کاغذ صافی واتمن فیلتر میشود بطوری که یک محلول صاف تشکیل میگردد.این محلول Deionized Formamideدر یخچال نگهداری میشود.
طرزتهیه بافرها:
الف ) بافرهای Detection (ظهور) :
1- بافرI:
Tris (PH:7.5) 100mM
NaCl 500mM
2- بافرII :
(1-3% BSA (blocking reagent که در بافر I 65درجه حرارت داه میشود تا حل شود
3- بافر III:
Tris (pH:9.5) 100mM
NaCl 100mM
MgCl2 50mM
ب) بافرهای Hybridization :
1- بافر Pre hybridization:
Deionized formamide 50%
SSC 5X
Denhardts 5X
hosphate buffer 50mM
SS DNA 125mg/ml
2- بافر Hybridization :
Deionized formamide 50%
SSC 5X
Denhardts 1X
Phosphat buffer 20mM
SS DNA 25mg/ml
Dextran sulfate 10%
3- محلول Denhardts :
BSA 1%
Ficoll 1%
Polyvinyl pyrolidone 1%
4- با فر 20X SSC :
NaCl 3M
Na Citrate 3M
pH: 7