همه چیز درمورد ریز تزریقی

[سید لفته فردزاده]

1. همسانه سازی ژن ( Gen cloning ) مورد نظر :
همسانه سازی می تواند نمونه خالصی از یک ژن منفرد بطور مجزا از کلیه ژنهای دیگر موجود در سلول فراهم کند . امروزه روشهای مختلفی برای همسانه سازی DNA مورد استفاده قرار می گیرد.


2. ایجاد همزمانی (Synchronization ) بین حیوان دهنده و حیوان گیرنده :
در تمامی تکنیکهای مختلفی که در آن ها ، تکنیک انتقال جنین مورد استفاده قرار می گیرد. (تولید حیوانات انتقال ژنی نیز یکی از این تکنیکها است.) از آنجا که جنین های حاصل از این تکنیکها در رحم حیواناتی غیر از حیوانات دهنده ( تخمک یا جنین ) قرار می گیرد ، باید بین حیوانات دهنده و حیوانات گیرنده جنین در سیکل تولید مثلی ، همزمانی ایجاد کرد. در این روش از طریق تزریق گنادو تروپینها با برنامه خاصی که در گونه های مختلف متفاوت است، بین حیوان دهنده و حیوانات گیرنده همزمانی ایجاد می شود . در برخی از گونه ها مانند جوندگان ، حیوانات گیرنده حتماً باید در آبستنی کاذب ( Pseudo pregnancy ) باشند . برای القاء آبستنی کاذب ، شرایط جفت گیری ماده ها با نرهای وابران برداری شده فراهم می شود . زیرا که تحریک شدن گردن رحم ( Cervix ) در جوندگان برای تداوم آبستنی ضروری است .

3. القاء تخمکگذاری چند تایی ( Superovulation )در حیوان دهنده تخمک :
بخش عمده تخمکهایی که امروزه در تحقیقات مورد استفاده قرار می گیرند ، بوسیله حیواناتی تولید می شوند که دارای خصوصیات ژنتیکی برجسته ای هستند . تخمدانهای این حیوانات به گونه ای تحریک می شوند که بتواند در یک چرخه تناسلی بیش از یک تخمک آزاد کند . مهمترین مشکلی که در برنامه های تخمکگذاری چند تایی وجود دارد متغییر بودن نتیجه تخمکگذاری در بین حیوانات و حتی در یک حیوان طی چندین برنامه القاء تخمکگذاری چندتایی است. در یک چرخه تناسلی طبیعی ، تنها یک فولیکول (Follicle ) که همان آخرین فولیکول غالب است ، تخمکگذاری انجام می دهد . در برنامه تخمکگذاری چندتایی ، درمان تخمدانها با گنادوتروپین ها ( Gonadotrophin hormones ) موجب می شود ، فولیکولهایی که در حال رشد هستند ، برای رشد کامل تحریک شده و تخمکگذاری انجام دهند . این هورمونها احتمالاً از تحلیل رفتن فولیکولهایی که در حال طی کردن رشد نهایی هستند نیز، جلوگیری می کند . در چنین شرایطی می توان پیش بینی کرد که تخمکهای موجود در این فولیکولها در شرایط کاملاً یکسانی آزاد نمی شوند . به عبارت دیگر تعدادی از تخمکها ممکن است به صورت نارس آزاد شوند و تعدادی نیز مدت طولانی پس از رسیده شدن منتظر آزاد شدن مانده باشند . این تخمکها معمولاً پس از آزاد شدن لقاح نمی یابند و تحلیل می روند . به همین دلیل ، تعداد جنینهای تولید شده معمولاً کمتر از تعداد تخمکهای آزاد شده است .

4. آماده سازی و اصلاح سلول تخم :
الف) تأمین سلول تخم :
سلول تخم بکار رفته درتکنیکهای انتقال ژن را هم می توان از طریق لقاح طبیعی، بدین صورت که پس از القاء تخمکگذاری چند تایی، حیوان دهنده ، دو بار متوالی تلقیح و یا جفت گیری می شود و جمع آوری سلول های تخم 12 تا 24 ساعت پس از باروری با شستشوی اویداکتها از طریق جراحی انجام می شود. اشکال این روش در آن است که ممکن است سلول تخم بدست آمده از مرحله تک سلولی گذشته باشد، که در صورت بروز این تغییر جنینهای بدست آمده نمی تواند در تکنیک ریزتزریق مورد استفاده قرار گیرد. یکی دیگر از روشهای فراهم کردن سلول تخم تکنیکهای تولید جنین آزمایشگاهی است که از این طریق نیز می توان سلول تخم مورد نیاز در انتقال ژن را تولید کرد.

ب) اصلاح سلول تخم :
در اطراف اغلب سلولهای تخم یک لایه سلولهای کومولوس وجود دارد که این سلول های موجود ، بوسیله آنزیم هیالورونیداز ( Hyaluronidase enzyme ) برداشته می شوند. تقریباً در همه حیوانات اهلی به دلیل وجود دانه های لیپیدی تیره در سیتوپلاسم سلول تخم ، هیچیک از ساختمانهای هسته ای قابل دیدن نیستند . سانتریفیوژ سلول تخم یک راه متداول برای قابل مشاهده کردن هسته از طریق تجمع چربی ها به صورت یک لایه در یک سمت از سلول تخم است .

5. قابل رویت شدن پیش هسته های سلول تخم لقاح یافته :
قابل رویت شدن پیش هسته های نر و ماده برای انجام عمل ریز تزریق در اغلب گونه ها ضروری است. عمل ریز تزریق پس از مشاهده این پیش هسته ها و تشخیص پیشهسته نر از ماده داخل پیش هسته نر صورت می گیرد . این مرحله در بعضی از گونه ها الزامی نیست .

6. تدارک یک محلول جهت ریز تزریق DNA
ساختار ژنی مورد نظر پس از همسانه سازی برای ریز تزریق در یک محلول بافر قرار داده می شود . برای اجتناب از بروز مشکلات طی مراحل ریز تزریق تمامی محلول های استفاده شده طی مراحل قبل از آماده سازی مایع ریز تزریق ، باید استریل و فاقد ذرات خارجی باشد . محلول ریز تزریق نیز باید فاقد هر گونه آلودگی و ذرات خارجی دیگر باشد و محلول DNA باید تا حدی رقیق شود که در هر پیکو لیتر ( 10-12 Lit) ، حاوی حدود 1000 نسخه از ساختار ژنی مورد نظر باشد .

7. ریزتزریق محلول حاوی DNA به داخل پیش هسته سلول تخم :
تجهیزات مورد نیاز جهت ریز تزریق شامل :
· میکروسکوپ اینورت (Invert microscope )
· دستگاه ظریف کار ( Micromanipulator )
· وسایل تزریق
· محفظه تزریق
· پیپت نگهدارنده
· پیپت تزریق
برای ریز تزریق DNA به داخل سلول تخم معمولاً از یک دستگاه ظریف کار و یک وسیله ریز تزریق که با هوا یا روغن کار می کند ، استفاده می شود . در این روش پس از سانتریفیوژ سلول تخم ، آن را در یک قطره محیط کشت قرار داده و روی قطره را با روغن سیلیکون می پوشانند تا مانع تبخیر آن شود . پس از قابل رویت شدن پیش هسته ها ، تخمک بوسیله پیپت نگهدارنده ، داخل قطره فوق مقید می شود. (عامل مقید کردن مکش بسیار ناچیزی است که توسط دستگاه در پیپت نگهدارنده ایجاد می شود.) در مرحله بعد پیپت تزریق با قطر 2-1میکرومتر (mµ) که حاوی محلول DNA است در جریان تزریق وارد پیش هسته تخم شده ، برای این عمل از لایه زونا ( Zonepellucida )، دیواره سلولی (Cell membrane ) و دیواره هسته ( Nucleus membrane ) عبور می کند . در حدود 2-1 پیکو لیتر (1012) از محلول DNA ، داخل یکی از پیش هسته ها که اغلب پیش هسته نر می باشد ، تزریق می شود.
با توجه به اینکه ریز تزریق DNA ، معمولاً در تخم تک سلولی انجام می شود ، ژن انتقالی در تمامی سلولهای رویان در حال رشد ، حضور خواهد داشت . حضور ژن انتقالی در سلولهایی که نهایتاً به سلولهای زاینده تبدیل می شوند ( اسپرم یا تخمک ) ، از پیامد های معمول این روش است و در نتیجه توارث پذیری ژن انتقالی ، در اولین نسل نوزادان انتقال ژنی پایه ، ممکن می شود . در این صورت ژن انتقالی را خطوط زاینده می گویند . با این حال، الحاق ساختار DNA ریز تزریق شده در ژنوم میزبان ، گاهی ممکن است بدون دلیل مشخصی به تأخیر افتد . در چنین مواردی ، اگر سلول رویان اولیه ، قبل از الحاق ژن انتقالی تقسیم گردد ، ژن انتقالی به برخی از سلولها منتقل شده و حیوانات پایه ای که از این راه تولید می شوند ، اگرچه باز هم انتقال ژنی محسوب می شوند ، ولی به عنوان حیوان موزائیک (حیواناتی که سلولهای آنها دارای ژنوم غیر یکسان می باشند) به شمار می آیند.

8. الحاق ژن انتقال یافته با ژنوم میزبان :
در عمل در جریان ریزتزریق می توان از تمامی ساختار DNA شبیه سازی شده ، استفاده کرد. بجز در چند مورد ، ساختار ژنی ریز تزریق شده بطور تصادفی در ژنوم میزبان و معمولاً فقط در یک نقطه از کرومزوم ( محل الحاق ) ، می تواند الحاق شود . برای مشاهده این پدیده می توان بیش از یک ساختار DNA را در آن واحد به سلول تخم تزریق نمود . در این صورت ، ساختارهای DNA تزریق شده ، مشترکاً به یک نقطه تصادفی یا همان محل الحاق متصل می شوند . روند الحاق به خوبی شناسایی نشده ، ولی ظاهراً نوترکیبی های همولوگ را شامل نمی شود . در خلال الحاق ، نسخه هایی از یک ژن انتقالی ( در واقع چند صد نسخه از یک ردیف خاص ) را وارد DNA ژنوم میزبان می کنند تا احتمال الحاق ژن مورد نظر به ساختار ژنی میزبان را افزایش دهند. به نظر می رسد که عوامل تنظیم کننده در DNA میزبان در محل الحاق ، میزان کلی در دسترس بودن این ناحیه برای نسخه برداری ، تأثیر اصلی در میزان بیان شدن ژن انتقالی را بر جای می گذارند . تصور می شود که اثر مکانی ، دلیلی برای تفاوت فاحش بیان شدن یک ژن انتقالی در افراد مختلف حیوانات پایه و نیز در نتاج ( یا لاین ) آنها باشند . بنابر این ، برای تعیین نتیجه الحاق ژن و نیز انعکاس فعالیت ژن انتقالی ، شرط احتیاط آن است که بیان شدن ژن انتقالی ، در حد اقل سه یا چهار حیوان انتقال ژنی پایه ، ارزیابی شود. DNA میزبان در نزدیکی محل الحاق ، به دلیل دخالت ژن انتقالی ، غالباً متحمل شکلهای مختلف رونویسی ردیفها ، حذف یا بازسازی آنها می شود. این گونه اختلال در صورت قوی بودن می تواند فعالیت طبیعی ژن میزبان را در محل الحاق مختل کرده و ساختار آن را وادار به جهش الحاقی کند و در نتیجه ، موجب بروز یک ناهنجاری تشریحی شود . اینگونه اتفاقات را که منجر به کشف تصادفی ژنها و فعالیتهای ژنی دور از انتظار می شوند ،نمی توان از قبل برنامه ریزی کرد .

9. انتقال تخم انتقال ژن یافته به داخل لوله رحمی حیوان گیرنده :
رویانهای حاصل از ریزتزریق پس از رشد مختصری در داخل آزمایشگاه و بررسی سلامت آنها از طریق جراحی به لوله های رحمی حیوانات گیرنده همزمان شده منتقل می شوند. حیوانات گیرنده باید قادرند به نگهداری رویان دریافتی تا پایان آبستنی در وضعیت مناسب باشد و در تمامی مراحل آبستنی باید ماده های گیرنده بطور دقیق تحت نظر باشند تا احتمال سقط جنین در آنها به حداقل کاهش یابد .

10. بررسی نوزادان متولد شده جهت اثبات وجود ژن انتقال یافته در ساختار ژنی آنها :
پس از تولد، نوزادان حاصل از جنین های انتقال ژن یافته ، باید برای تأیید موفقیت عملیات انتقال ژن مورد نظر در ساختار ژنی حیوان ، آزمایش شود . ترکیب DNA تزریق شده و تعداد رونوشتهای ترکیب شده را می توان از طریق پردازش به روش ساترن بلات ( Southern Blot ) یا دات بلات ( Dot Blot ) و محل پیوند در جریان هیبرید شدن کروماتین در متافاز می تواند از طریق استفاده از نشانگر ( Probe ) مشخص شود . پس از اثبات این امر حیواناتی که واجد ژن انتقالی می باشند، پرورش داده می شوند و سپس جفتگیری می کنند . نوزادان بدست آمده از این جفتگیریها مورد آزمایش قرار می گیرند تا معلوم شود که آیا ژن انتقالی به فرزندان منتقل شده است . کوششهایی برای تولید حیوانات هموزیگوس ( Homozygous ) ( دارای جفت آلل مشابه در در جایگاه ژنی یک صفت ) انتقال ژنی ، از طریق جفت گیری حیوانات انتقال ژنی همی زیگوس ( Hemizygous ) ( دارای جفت آلل غیر مشابه در جایگاه ژنی یک صفت ) نسل اول با هم ، انجام شده است .

مزایای روش ریز تزریق DNA عبارت است از :
1. تناوب نسبتاً بالای تولید حیوانات انتقال ژنی نسبت به روشهای دیگر
2. احتمال بالای انتقال ژن انتقالی به لاین زاینده
3. فقدان نسبی محدودیت در مورد اندازه یا نوع ساختار DNA مورد استفاده
4. ثبات نسبی ژن انتقالی با توجه به انتقال آن از نسلی به نسل دیگر
5. تناوب کم موزائیک شدن حیوان یا الحاق در دو نقطه

معایب روش ریز تزریق DNA عبارت است از :
1. تأثیر بالقوه مهمی که محل الحاق می تواند روی بیان ژن بگذارد
2. احتمال وقوع جهشهای الحاقی نامطلوب
3. احتمال تولید حیوانات پایه موزائیک
4. احتمال فقدان درگیر شدن لاین زاینده
5. زمان و هزینه های لازم برای کسب مهارت در ظریف کاری و ریزتزریق

علی رغم پیشرفتهایی که در دو دهه اخیر در تکنیک انتقال ژن به روش ریز تزریق ایجاد شده است ، باز هم تعداد حیوانات انتقال ژنی سالم متولد شده ، نسبت به تعداد جنینهای انتقال ژنی ایجاد شده ، بسیار ناچیز است . در جدول زیر راندمان تولید حیوانات انتقال ژنی زنده متولد شده ، نسبت به تعداد ریزتزریق انجام شده داخل پیش هسته سلول تخم لقاح یافته ، درچهار گونه متداول از حیوانات مزرعه آورده شده است.

گونه
تعداد ریزتزریق انجام شده به داخل پیش هسته سلول تخم
تعداد حیوان انتقال ژن یافته زنده متولد شده
تعداد ریزتزریق برای هر حیوان متولد شده
راندمان تولید حیوانات انتقال ژنی از این طریق
گاو
گوسفند
بز
خوک
5030
5394
985
22429
8
45
12
182
625
125
83
125
% 0/16
% 0/80
% 1/20
% 0/80