الکتروفورز

[سید لفته فردزاده]

الکتروفورز از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول ها است. به طورکلی الکتروفورز حرکت ذرات پراکنده در داخل مایعی تحت تأثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. همین حرکت در فضایی با میدان الکتریکی غیریکنواخت دی الکتروفورز نامیده می شود. الکتروفورز تکنیکی است که برای جداسازی و در برخی مواقع خالص سازی ماکرومولکولها مخصوصا پروتئین ها و اسید های آمینه که در اندازه، بار و ترکیب متفاوتند، به کار می رود. زمانیکه مولکولهای بارگذاری شده در یک میدان الکتریکی قرار می گیرند، بر اساس بار الکتریکی شان به سمت قطب مثبت (آند) یا منفی (کاتد) حرکت می کنند. سرعت حرکت مولکول ها در این شرایط نه تنها تحت تأثیر بار الکتریکی و شدت میدان الکتریکی است، بلکه عواملی نظیر اندازه، وزن مولکولی و شکل فضایی مولکول نیز در این امر دخیل هستند.

همچنین اثرات محیطی نیز نوع و نحوه استفاده از بافرها و حرارت ایجاد شده در حین کار نیز از عوامل مؤثر بر جداسازی مولکول های نمونه هستند. معمولاً الکتروفورز برای تفکیک مولکول های بزرگی چون پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار برده می شود، اما در مواردی نیز برای جداسازی مولکول های باردار کوچک تر نظیر قندها، اسیدهای آمینه، پپتیدها و حتی یون های ساده مورد استفاده قرار می گیرد.
پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک در یک ماتریکس یا ژل الکتروفورز می شوند. به طور معمول، ژل قالبی به شکل ورقه ای نازک با چاهک هایی جهت بارگذاری نمونه می باشد. ژل در داخل بافر الکتروفورز که مولکولهای حاوی بار الکتریسیته را جهت برقراری جریان فراهم می سازد، قرار داده می شود. لازم به ذکر است که بافر الکتروفورز، PH را در یک میزان ثابتی نگه می دارد. هر یک از انواع ژل (آگارز یا اکریلامید) دارای خصوصیات و وظایف خاص خود می باشند.در حال حاضر آگارز و پلی کریل آمید متداول ترین و پرکاربردترین ماده به عنوان واسط در الکتروفورز ژلی محسوب می شوند. در اغلب دستگاه های الکتروفورز، ژل مابین دو محفظه بافری قرار می گیرد به طوری که ژل تنها واسطه در عبور جریان الکتریسیته بین این دو محفظه می باشد. هر دو شبکه خلل و فرج داری تولید می کنند که میکرومولکول هایی بارداری را که در پاسخ به میدان الکتریکی جابجا می شوند در خود جای می دهند. به عنوان مثال زمانی که جریان اعمال می شود، DNA های با بار منفی به سمت الکترودهای باردار مثبت حرکت می کنند. خلل و فرج های موجود در شبکه ژلی انتقال مولکول های بزرگ را محدود می کنند و این در حالی است که مولکول های کوچک تر با آزادی بیشتری منتقل می شوند و در فاصله دورتری از الکترودها قرار می گیرند. این غربال مولکولی مولکول ها را بر مبنای سایزشان جدا می کند. همچنین می توان مولکول ها را بر مبنای بار اولیه ای که داشتند جداسازی کرد. مولکول هایی که بار بیشتری دارند تحرک الکتروفورزی بیشتری از خود نشان می دهند و سریع تر منتقل می شوند.بدین ترتیب درون ژل با اولویت باری که داشتند قرار می گیرند. جداسازی بر مبنای بار به ژلی نیاز دارد که مانند آگارز دارای خلل و فرج های بزرگ تری باشند. آگارز برای جداسازی اسید نوکلئیک ها و پروتئین های خیلی بزرگ یا ترکیب ها استفاده می شود. آگارز یک پلی ساکارید طبیعی است که ازنوع خاصی جلبک دریایی قرمز به دست می آید. زمانی که گرما داده شده و سپس سرد می شوند به صورت جامد متخلخلی با خلل و فرج های نسبتاً بزرگ تبدیل می شوند.
الکتروفورز ژل آگاز(AGE) را می توان برای جداسازی مولکول ها بر مبنای بار یا وزن مولکولی شان استفاده کرد. یکی از مهم ترین کاربردهای AGE جداسازی بخش های حاصل از برش DNA با آنزیم های محدودکننده است.
اکثر روش های مربوط به تفکیک پروتئین ها که امروزه از آنها استفاده می شود بر مبنای الکتروفورز منطقه ای یا ناپیوسته ژل های پلی آکریل آمید استوار است. الکتروفورز منطقه ای روی ژل پلی آکریل آمید تحت عنوان "PAGE" شناخته می شود. در این روش از تفاوت وزن مولکولی و بار الکتریکی پروتئین ها به طور همزمان برای تفکیک آنها از یکدیگر استفاده می شود.
نحوه ایجاد منافذ های با اندازه متفاوت
ژل پلی آکری آمید محدوده گسترده ای از اندازه های حفرات ژلی را در بر می گیرد.
ژل پلی آکری آمید با پلیمریزاسیون آکریل آمید مونومریک و مونومر ایجاد کننده پیوند متقاطع Cross Linker، بیس آکریل آمید شکل می گیرند.
پلیمریزاسیون آکریل آمید و بیس آکریل آمید می تواند به صورت شیمیایی، با تترامتیل اتیلن دیامین TEMED و آمونیوم پرسولفات، یا سیستم فتوشیمیایی باشد.
رادیکال های آزاد پرسولفات که با حل آمونیوم پرسولفات در آب ایجاد می شوند مونومر آکریل آمید را فعال کرده و «TEMED» در این واکنش با انتقال الکترون این واکنش را کاتالیز می کند. در عین حال ریبوفلاوین می تواند در حضور اکسیژن و اشعه UV رادیکال آزاد تولید کند. بعضی مواقع از ریبوفلاوین و آمونیوم پرسولفات برای ایجاد رادیکال های آزاد استفاده می شود.
اندازه منافذ ژل عامل اصلی در تعیین قدرت تفکیک پروتئین ها و پلی پپتیدها در ژل های پلی آکریل آمید است. اندازه منافذ با دو پارامتر مشخص می شوند: محتوای کل ماده جامد یا T% و نسبت مونومر ایجاد کننده پیوند متقاطع به مونومر آکری آمید یا C%.
بدین ترتیب پلیمرهای آکریل آمید می توانند منافذی با اندازه های بسیار متفاوتی را ایجاد کنند. با تغییر در غظت آکریل آمید و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه منافذ امکان پذیر است. برای مثال، با افزایش نسبت پیوندهای متقاطع، اندازه منافذ کاهش می یابد. انتخاب دقیق و درست غلظت ژل آکریل آمید برای جداسازی بهینه پروتئین ها در الکتروفورز ضروری است.



محدوده اندازه مولکولی قابل تفکیک (KD)
درصد آکریل آمید در ژل
205-36
5%
205-24
5/7%
205-14
10%
66-14
12%
45-14
15%


درصد آکریل آمید برای جداسازی پروتئین هایی با اندازه های مختلف
نوع دیگری از الکتروفورز، الکتروفورز مویین (CE) است.این تکنیک که عمده ترین کاربرد آن در شیمی دارویی و درمانی است، برای جداسازی مولکول های درشت و ریز در مجاری بسیار نازک (با قطر داخلی 200-20 میکرومتر) استفاده می شود. در این روش، جداسازی با ولتاژ بالا 10-30 (KV) امکان پذیر می شود. از محاسن CE می توان به سرعت دستیابی به نتیجه در آنالیز یون ها اشاره کرد. به طور کلی CE بیشتر زمانی مطرح می شود که با آنالیت های باردار با پلاریته و قطبیت زیاد سر و کار دارد.
پروتئین ها به علت خصوصیات آمفوتری خود تحت تأثیر PH محیطی که در آن قرار داشته باشند بار الکتریکی خاص خود را نشان می دهند. بدین ترتیب در جداسازی توسط الکتروفوز باید PHمحلول های مورد استفاده ثابت باقی بماند از آن جا که الکترولیز آب در آنود یون های "H+" و در کاتود یون های "OH-" ایجاد می کند برای ثابت نگاه داشتن PH محلول های مورد استفاده آن ها باید بافر شوند.
برای حفظ تکرار پذیری ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسیار مهم است. برای مثال پلی مریزه شدن آکریل آمید یک واکنش گرما زا است، از این رو گرمای ایجاد شده در حین پلی مریزاسیون، به خصوص در مورد ژل های غلیظ تر، ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بی نظمی دراندازه منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولاً مشکلی در ژل هایی با غلظت کمتر از 15%T نمی کند. به هر حال گرمای زیاد در حین الکتروفورز مشکلات دیگری را نیز پدید می آورد؛ شکستن شیشه های الکتروفورز، آسیب به دستگاه، وقتی که حرارت به صورت یک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهای جدا شده نامنظم شود و در اصطلاح باندها خندان می شوند چون نمونه ها در ردیف های وسط سریع تر از ردیف های کناری حرکت خواهند کرد.
انجام الکتروفورز :
1. قالب ژل را آماده کنید.
2. شانه ای با دنده های مناسب روی قالب قرار دهید.
3. حجم ژل مورد نظر را تعیین کنید (اندازه گیری طول و عرض قالب و قطر ژل موردنظر)
4. پودر آگازر را وزن کنید.
5. آگازر را در بافر xTBE حل کنید و آن را حرارت دهید تا کاملا ذوب شده و مایعی شفاف بدست آید و قبل از خنک شدن داخل قالب بریزید.
6. بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید.