سید لفته فردزاده
3rd August 2015, 05:26 PM
چرخه سلولی به وسیله فعالیت کینازهای وابسته به سیکلین (Cdk) که فسفریلاسیون زنجیره جانبی سرین یا ترئونین را در سوبسترای پروتئینی کاتالیز می کند تنظیم می شود. فعالیت Cdks از طریق پروتئین کینازهای دیگر، پروتئین فسفاتازها، اتصال به پروتئین های سیکلین و وجود یا عدم وجود پروتئین های مهارکنندهCdk تنظیم می شود. در هر مورد ابتدا یک پروتئین مختص Cdk سنتز شده و پس از اتصال به Cdk خود هترودیمرCdk-Cycline را به وجود می آورد. سپس فسفات فعال کننده مناسب به وسیله کیناز فعال کننده وابسته به سیکلین (CAK) اضافه شده و فسفات مهاری به وسیله فسفاتاز CDC25 جدا می شود و Cdk فعالی به وجود می آید که مراحل سیکل سلولی را تنظیم می کند. در انتهای هر مرحله از سیکل سلولی کمپلکسCdk-Cycline به وسیله یوبی کوئیتین لیاز، پلی یوبی کوئیتینه می شود و پس از تجزیه این سیکلین های پلی یوبی کوئیتینه، فعالیت Cdk از بین رفته و مسیر سیکل سلولی به مرحله بعد پیشرفت می کند.
سیکلین D با فعال سازی Cdk4 و Cdk6 باعث ورود چرخه سلولی به فاز G1 می شود. سیکلین A و E با فعال سازی Cdk2 باعث ورود چرخه سلولی به فاز S می شود. سیکلین B با فعال سازیCdk1 باعث ورود چرخه سلولی به فازM می شوند.
پروتئین های سرکوب کننده تومور:
پروتئین رتینوبلاستوما (Rb):
این پروتئین در فازهای G0 وG1 در حالت غیرفسفریله است و Rb غیر فسفریله به فاکتور نسخه برداریE2F متصل شده و فعالیت آن را متوقف می کند. با فسفریله شدن Rb به وسیله G1 وG1/S-Cdks ، پروتئینRb تغییر کنفورماسیون داده و E2Fآزاد می شود. Rb غیر فسفریله شکل فعال Rb است و باعث مهار و متوقف شدن E2F می شود. شکل فسفریلهRb شکل غیر فعال آن است که عمل E2F را متوقف نمی کند.
برای ایجاد رتینوبلاستوما نیاز به جهش در هر دو آلل ژن Rb می باشد که در دو حالت دیده می شود:
حالت شایع که در حدود 40% موارد یک ژن جهش یافته به ارث رسیده و ژن دیگر دچار جهش پیکری می شود.
حالت تک گیر که در حدود 60% ژن های سالم به ارث رسیده سالم بوده و هر دو آلل یک سلول دچار جهش می گردند.
پروتئین :p53
به عنوان یک فاکتور رونویسی بیان پروتئینP21 را تحریک می کند و پروتئین P21 باعث مهارG1 و G1/S-Cdks و در نتیجه مهار فسفریلاسیون Rb می شود. Rb غیر فسفریله به E2F متصل شده و از ورود سلول به فازS جلوگیری می کند.
برای تومورزایی نیاز به جهش در هر دو آلل p53 یا جهش در یک آلل و از دست رفتن یا کاهش فعالیت دیگری است، بنابراین از نوع مغلوب است. در حدود 50% از سرطان ها به دلیل جهش یا تخریب ژن p53 می باشند. در حدود 50% از سرطان هایی که دارای ژن p53 نرمال می باشند، اغلب p53 آن ها ناقص است. اکثر جهش های شناخته شده در ژن p53 از نوع بدمعنی (missense) هستند که در دومن اتصال به DNAژن p53 قرار گرفته اند. افرادی که یک جهش زیان آور در ژنp53 را به ارث می برند، مبتلا به سندرم لی-فرامنی (Li-Fraumeni) هستند (اتوزوم غالب)،که احتمال ابتلاء به چند سرطان را دارند.
غلظتp53 به وسیله سرعت نسخه برداری از ژن آن تعیین نمی شود بلکه به وسیله سرعت تجزیه پروتئین p53 تعیین می شود. تجزیه p53 ناشی از Mdm2، یک لیگاز یوبی کوئیتینه کننده E3 می باشد. Mdm2 کاتالیز کننده پلی یوبی کوئیتینه شدن موجب تجزیهp53 به وسیله پروتئازوم می شود. همچنین میزان p53 سلول به وسیله فاکتورهای نسخه برداری Myc و E2F تنظیم می شود. در شرایط نامناسب برای تقسیم سلول میزان افزایش یافته فاکتورهای نسخه برداری Myc وE2F موجب افزایش سنتز پروتئین Arf که بهMdm2 متصل شده و از تجزیه p53 جلوگیری می کند.
پروتئین های نوروفیبریلین (NF):
جهش در ژن پروتئینNF-1 که در تنظیم G-پروتئین های شبهRas دخالت دارد و نیز پروتئینNF-2 که در ارتباط پروتئین های اسکلت سلولی و غشاء نقش دارد، منجر به ایجاد نوروفیبروسارکوما و تومور مغزی می شود که اغلب به صورت اتوزومی غالب به ارث می رسد. اگر چه در 50 درصد موارد سابقه فامیلی وجود ندارد و تا حد زیادی ناشی از جهش های خود به خودی در ژن نوروفیبریلین است.
آپوپتوز:
مسیرهای مرگ سلولی: 1. مسیر رسپتور مرگ سلولی (مسیر خارجی)
2. مسیر میتوکندریایی مرگ سلولی (مسیر داخلی)
مسیر خارجی مرگ سلولی:
این مسیر با اتصال یک لیگاند مرگ موجود در محیط خارج از سلول به گیرنده مرگ واقع در غشاء پلاسمایی آغاز می شود. اتصال لیگاند مرگ باعث اتصال پروتئین های سازش داخل سلولی به ناحیه سیتوپلاسمی پروتئین رسپتور در غشاء پلاسمایی می شود. در این مسیر پروکاسپاز 8 با هیدرولیز اتوکاتالیتیکی یکی از پیوندهای خود به کاسپاز 8 فعال تبدیل می شود. کاسپاز 8 تجمع را ترک کرده و آبشار کاسپازی را آغاز می کند.
مسیر داخلی مرگ سلولی:
در این مسیر پروتئین های پروآپوپتوتیک مانندBax و Bak باعث افزایش نفوذ پذیری غشاء میتوکندری و آزاد شدن سیتو کروم C از غشای داخلی میتوکندری می شوند. در سیتوپلاسم سیتوکرومC به یک پروتئین مجتمع شامل مولکول های چند تایی پروتئین آداپتور APaF1 و پروکاسپاز متصل می شود. علاوه بر این سیتوکرومC در آپوپتوزوم باعث هیدرولیزاتوکاتالیتیکی پیوندهای پپتیدی خاصی در توالی پروکاسپاز 9 و ایجاد کاسپاز 9 فعال و فعال شدن آبشار کاسپازی می شود.
پروتئین های دیگری غیر از سیتوکروم C که از غشاء نفوذپذیر میتوکندری عبور می کند آپوپتوز غیر وابسته به سیتوکرومC را در شرایط خاص اغاز می نماید. پروتئین Smac وارد سیتوپلاسم شده و XIAP (پروتئین مهار کننده پروتئاز کاسپازی) را که در حالت نرمال فعالیت کاسپاز پایه را در غیاب پیام های فعال کننده پیش آپوپتوزی محدود می کند، مهار می نماید.
فعال شدن c-jun N-terminal MAPK(JNK) می تواند موجب آپوپتوز می شود. JNK با فسفریلاسیون BCl-2 که یک فاکتور آنتی آپوپتوتیک است موجب جدا شدن آن از میتوکندی و در نتیجه مرگ سلولی می شود. JNK با فسفریله کردن p53 باعث مقاومت آن به یوبی کوئیتیناسیون توسطMdm2 می شود.
پروتئین های پروآپوپتوتیک:Bim ، Bad، Bid، Bak، Bax، Bcl-xs (Bim باعث افزایش فعالیت Bax می شود).
پروتئین های آنتی آپوپتوتیک: Bcl-XL، Bcl-2 برخی عوامل دخیل در تومورزایی:
سلول های بدخیم پروتئازهای اوروکیناز فعال کننده پلاسمینوژن (UPA) و پروکلاژناز نوع 4 را تولید می کنند یا استرومای مجاور را برای تولید و ترشح این پروتئازها تحریک می کنند. کلاژناژ نوع 4 یکی از اعضای خانواده ماتریکس متالوپروتئینازها (MMP) می باشد. آنزیم های MMPدارای یک اتم فلز (Zn) در جایگاه کاتالیتیکی خود می باشند. دو ژن به نام های MMP2 وMMP9 کد کننده پروکلاژنازهای نوع 4 می باشند.
توالی N ترمینال پلاسمینوژن که به وسیله فعالیت پروتئولیزی پلاسمینوژن تولید می شود به طور قابل توجهی دارای فعالیت ضد رگ زایی بوده و آنژیوتانسین نامیده می شود. پروتئین اندوستاتین که از انتهای C ترمینال کلاژن نوع X8 تولید می شود نیز خاصیت ضد رگ زایی دارد.
روش های بررسی مرگ سلولی:
روش MTT:
ترکیب MTT نمک زرد رنگ تترازولیوم محلول در آب است که توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری های سلول های زنده و فعال احیاء و به ترکیب رنگی فورمازان نامحلول تبدیل می شود که این رنگ با حلال آلی حل گشته و شدت رنگ در طول موج 570 نانومتر متناسب با میزان سلول های زنده است.
رنگ آمیزی تریپان بلو:
غشای سلول های مرده به رنگ ها نفوذپذیر است در حالی که در سلول های زنده، غشای سلول به رنگ نفوذناپذیر است. تریپان بلو از جمله رنگ هایی است که برای تمایز سلول های زنده از مرده توسط میکروسکوپ نوری به کار می رود. سلول های مرده در زیر میکروسکوپ به رنگ آبی هستند. درصد سلول های مرده با استفاده از لام نئوبار محاسبه می شود.
سیکلین D با فعال سازی Cdk4 و Cdk6 باعث ورود چرخه سلولی به فاز G1 می شود. سیکلین A و E با فعال سازی Cdk2 باعث ورود چرخه سلولی به فاز S می شود. سیکلین B با فعال سازیCdk1 باعث ورود چرخه سلولی به فازM می شوند.
پروتئین های سرکوب کننده تومور:
پروتئین رتینوبلاستوما (Rb):
این پروتئین در فازهای G0 وG1 در حالت غیرفسفریله است و Rb غیر فسفریله به فاکتور نسخه برداریE2F متصل شده و فعالیت آن را متوقف می کند. با فسفریله شدن Rb به وسیله G1 وG1/S-Cdks ، پروتئینRb تغییر کنفورماسیون داده و E2Fآزاد می شود. Rb غیر فسفریله شکل فعال Rb است و باعث مهار و متوقف شدن E2F می شود. شکل فسفریلهRb شکل غیر فعال آن است که عمل E2F را متوقف نمی کند.
برای ایجاد رتینوبلاستوما نیاز به جهش در هر دو آلل ژن Rb می باشد که در دو حالت دیده می شود:
حالت شایع که در حدود 40% موارد یک ژن جهش یافته به ارث رسیده و ژن دیگر دچار جهش پیکری می شود.
حالت تک گیر که در حدود 60% ژن های سالم به ارث رسیده سالم بوده و هر دو آلل یک سلول دچار جهش می گردند.
پروتئین :p53
به عنوان یک فاکتور رونویسی بیان پروتئینP21 را تحریک می کند و پروتئین P21 باعث مهارG1 و G1/S-Cdks و در نتیجه مهار فسفریلاسیون Rb می شود. Rb غیر فسفریله به E2F متصل شده و از ورود سلول به فازS جلوگیری می کند.
برای تومورزایی نیاز به جهش در هر دو آلل p53 یا جهش در یک آلل و از دست رفتن یا کاهش فعالیت دیگری است، بنابراین از نوع مغلوب است. در حدود 50% از سرطان ها به دلیل جهش یا تخریب ژن p53 می باشند. در حدود 50% از سرطان هایی که دارای ژن p53 نرمال می باشند، اغلب p53 آن ها ناقص است. اکثر جهش های شناخته شده در ژن p53 از نوع بدمعنی (missense) هستند که در دومن اتصال به DNAژن p53 قرار گرفته اند. افرادی که یک جهش زیان آور در ژنp53 را به ارث می برند، مبتلا به سندرم لی-فرامنی (Li-Fraumeni) هستند (اتوزوم غالب)،که احتمال ابتلاء به چند سرطان را دارند.
غلظتp53 به وسیله سرعت نسخه برداری از ژن آن تعیین نمی شود بلکه به وسیله سرعت تجزیه پروتئین p53 تعیین می شود. تجزیه p53 ناشی از Mdm2، یک لیگاز یوبی کوئیتینه کننده E3 می باشد. Mdm2 کاتالیز کننده پلی یوبی کوئیتینه شدن موجب تجزیهp53 به وسیله پروتئازوم می شود. همچنین میزان p53 سلول به وسیله فاکتورهای نسخه برداری Myc و E2F تنظیم می شود. در شرایط نامناسب برای تقسیم سلول میزان افزایش یافته فاکتورهای نسخه برداری Myc وE2F موجب افزایش سنتز پروتئین Arf که بهMdm2 متصل شده و از تجزیه p53 جلوگیری می کند.
پروتئین های نوروفیبریلین (NF):
جهش در ژن پروتئینNF-1 که در تنظیم G-پروتئین های شبهRas دخالت دارد و نیز پروتئینNF-2 که در ارتباط پروتئین های اسکلت سلولی و غشاء نقش دارد، منجر به ایجاد نوروفیبروسارکوما و تومور مغزی می شود که اغلب به صورت اتوزومی غالب به ارث می رسد. اگر چه در 50 درصد موارد سابقه فامیلی وجود ندارد و تا حد زیادی ناشی از جهش های خود به خودی در ژن نوروفیبریلین است.
آپوپتوز:
مسیرهای مرگ سلولی: 1. مسیر رسپتور مرگ سلولی (مسیر خارجی)
2. مسیر میتوکندریایی مرگ سلولی (مسیر داخلی)
مسیر خارجی مرگ سلولی:
این مسیر با اتصال یک لیگاند مرگ موجود در محیط خارج از سلول به گیرنده مرگ واقع در غشاء پلاسمایی آغاز می شود. اتصال لیگاند مرگ باعث اتصال پروتئین های سازش داخل سلولی به ناحیه سیتوپلاسمی پروتئین رسپتور در غشاء پلاسمایی می شود. در این مسیر پروکاسپاز 8 با هیدرولیز اتوکاتالیتیکی یکی از پیوندهای خود به کاسپاز 8 فعال تبدیل می شود. کاسپاز 8 تجمع را ترک کرده و آبشار کاسپازی را آغاز می کند.
مسیر داخلی مرگ سلولی:
در این مسیر پروتئین های پروآپوپتوتیک مانندBax و Bak باعث افزایش نفوذ پذیری غشاء میتوکندری و آزاد شدن سیتو کروم C از غشای داخلی میتوکندری می شوند. در سیتوپلاسم سیتوکرومC به یک پروتئین مجتمع شامل مولکول های چند تایی پروتئین آداپتور APaF1 و پروکاسپاز متصل می شود. علاوه بر این سیتوکرومC در آپوپتوزوم باعث هیدرولیزاتوکاتالیتیکی پیوندهای پپتیدی خاصی در توالی پروکاسپاز 9 و ایجاد کاسپاز 9 فعال و فعال شدن آبشار کاسپازی می شود.
پروتئین های دیگری غیر از سیتوکروم C که از غشاء نفوذپذیر میتوکندری عبور می کند آپوپتوز غیر وابسته به سیتوکرومC را در شرایط خاص اغاز می نماید. پروتئین Smac وارد سیتوپلاسم شده و XIAP (پروتئین مهار کننده پروتئاز کاسپازی) را که در حالت نرمال فعالیت کاسپاز پایه را در غیاب پیام های فعال کننده پیش آپوپتوزی محدود می کند، مهار می نماید.
فعال شدن c-jun N-terminal MAPK(JNK) می تواند موجب آپوپتوز می شود. JNK با فسفریلاسیون BCl-2 که یک فاکتور آنتی آپوپتوتیک است موجب جدا شدن آن از میتوکندی و در نتیجه مرگ سلولی می شود. JNK با فسفریله کردن p53 باعث مقاومت آن به یوبی کوئیتیناسیون توسطMdm2 می شود.
پروتئین های پروآپوپتوتیک:Bim ، Bad، Bid، Bak، Bax، Bcl-xs (Bim باعث افزایش فعالیت Bax می شود).
پروتئین های آنتی آپوپتوتیک: Bcl-XL، Bcl-2 برخی عوامل دخیل در تومورزایی:
سلول های بدخیم پروتئازهای اوروکیناز فعال کننده پلاسمینوژن (UPA) و پروکلاژناز نوع 4 را تولید می کنند یا استرومای مجاور را برای تولید و ترشح این پروتئازها تحریک می کنند. کلاژناژ نوع 4 یکی از اعضای خانواده ماتریکس متالوپروتئینازها (MMP) می باشد. آنزیم های MMPدارای یک اتم فلز (Zn) در جایگاه کاتالیتیکی خود می باشند. دو ژن به نام های MMP2 وMMP9 کد کننده پروکلاژنازهای نوع 4 می باشند.
توالی N ترمینال پلاسمینوژن که به وسیله فعالیت پروتئولیزی پلاسمینوژن تولید می شود به طور قابل توجهی دارای فعالیت ضد رگ زایی بوده و آنژیوتانسین نامیده می شود. پروتئین اندوستاتین که از انتهای C ترمینال کلاژن نوع X8 تولید می شود نیز خاصیت ضد رگ زایی دارد.
روش های بررسی مرگ سلولی:
روش MTT:
ترکیب MTT نمک زرد رنگ تترازولیوم محلول در آب است که توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری های سلول های زنده و فعال احیاء و به ترکیب رنگی فورمازان نامحلول تبدیل می شود که این رنگ با حلال آلی حل گشته و شدت رنگ در طول موج 570 نانومتر متناسب با میزان سلول های زنده است.
رنگ آمیزی تریپان بلو:
غشای سلول های مرده به رنگ ها نفوذپذیر است در حالی که در سلول های زنده، غشای سلول به رنگ نفوذناپذیر است. تریپان بلو از جمله رنگ هایی است که برای تمایز سلول های زنده از مرده توسط میکروسکوپ نوری به کار می رود. سلول های مرده در زیر میکروسکوپ به رنگ آبی هستند. درصد سلول های مرده با استفاده از لام نئوبار محاسبه می شود.