sevda_sj
23rd October 2013, 06:17 PM
جهش زایی هدفمند پس از اینکه در سال 1978 توسط هوچینسون و همکارانش تعریف شد بعنوان یک ابزار قدرتمند برای مطالعه ساختار مولکولی و عملکرد پروتئینها به کار گرفته شده است. هدف از جهش زایی هدفمند تغییر پروتئین نوترکیب از طریق واردسازی، جایگزین سازی،یا حذف یک آمینواسید ویژه می باشد.این تکنیک انجام تغییرات مورد نظر با دقت عالی را ممکن می سازد .
جهش زایی هدفمند به منظور تغییرفعالیت وپایداری آنزیم ها و همچنین تغییر ویژگی و تنظیم غیر تصادفی ژنهای نشانگر مستقل در ماده زمینه مورد استفاده قرار گرفته است. بطوریکه بیشتر آنزیم پاک کنندگی بیولوژیکی که در آمریکا(سالانه معادل 200 میلیون دلار) فروخته میشود از نوع پروتئین مهندسی شده تغییر یافته ازآنزیم بومی می باشد.
مرحله اول جهش زایی هدفمند کلون کردن ژن به پروتئین به منظور بررسی آن بصورت یک وکتور می باشد. این عملیات تفصیلی در بخش دیگری از این کتاب مورد بحث و بررسی قرار می گیرد. در مرحله بعدی، یک اولیگونوکلئوتید طراحی و ترکیب داده می شود.
این اولیگونوکلئوتید یک جهش مطلوبی خواهد داشت DNA که در مرکز واقع بوده و بوسیله توالیهای DNA که مکمل یک منطقه ویژه مورد نظر هستند، احاطه میشود. بنابراین، اولیگونوکلئوتید به منظور پیوند دادن تنها یک منطقه از ژن مورد نظر طراحی می شود. جهش سپس میتواند از طریق دورگ سازی اولیگونوکلئوتید باالگوی تک رشتهای به درون ژن انتقال داده می شود.
الگوهای تک رشته ای ژن مورد نظر ممکن است یا از طریق کلون کردن ژن به یک وکتور تک رشتهای از قبیلباکتریوفاژ ، یا با استفاده از فاگمیدها(یک پلاسمید کژزاد که درگیرنده یک منشا رونوشتی از باکتریخوار رشته ای که تک رشته ای بوسیله یک DNA هدایت ترکیب یک باکتریوفاژ کمک کننده را بر عهده دارد) حاصل شود . یک روش دیگر برای تولید الگوی تک رشتهای می تواند از طریق هضم DNA دو رشتهای با اگزونوکلئاز III پسازایجاد شکاف در یکی از رشته های DNA هدف با DNase یا یک اندونوکلئاز محدودکننده عملی شود.
ترکیب رشته دوم با دی ان ای پلیمراز با بهره گیری از اولیگونوکلئوتید بعنوان یک پرایمر صورت می پذیرد، و دی ان ای می تواند با دی ان ای لیگاز دایره ای شود. وکتوری که حامل دی ان ای نوترکیب می باشد(که در آن یک رشته جهش یافته است)میتواند به درون یک میزبان باکتریایی انتقال داده شودکه در آنجا بدلیل کپی شدن دی ان ای در
یک حالت نیمه حفاظتی، انتظار می رود که نیمی از سلولهای جدیدا ترکیب شده و حاوی دی ان ای دارای جهش باشد. پلیمریزاسیون دی ان ای نارس، اصلاح عدمتطبیق دی ان ای و ترکیب جابجا شدگی رشته عملا موجب عملکرد بسیار پایین جهش یافته ها می شود.
استراتژیهای مختلفی برای رسیدن به سطح بالاتری از کارایی جهشی با هدف کمینه سازی غربالگری جهش یافته توسعه داده شده اند. همزمان با الیگونوکلئوتیدهدفمند،الیگ ونوکلئوتید موتاژن دیگری که در برگیرنده یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک فعال می باشد میتواند وارد شود. در نتیجه پلاسمید نوع وحشی در یک محیطانتخابگر آنتی بیوتیک از بین خواهد رفت.
علاوه بر این، وارد ساختن اولیگونوکلئوتید موتاژنی دیگر می تواند موجب از بین رفتن یک اندونوکلئاز محدودکننده منحصر بفرد در رشته جهش یافته شود .
از این رو، پلاسمید نوع وحشی می تواند با این اندونوکلئاز محدودکننده منحصربفرد خطی سازی شود، بطوریکه پلاسمید جهش یافته دایرهای می تواند به میزبانباکتریایی تبدیل شود. روش جایگزین دیگر، اجرای بسط رشته دوم در حضور 5-متیل -دئوکسی سیتوزین تری فسفات می باشد که موجب مقاومت تعدادی از آنزیم های
محدودکننده در رشته جهش یافته میشود.
دی ان ای الگو سپس می تواند بوسیله این آنزیم هابرش سطحی شود، که بدنبال آن به منظور افزایش کارآیی جهش زایی هضم با اگزونوکلئاز 3 صورت می پذیرد.
پیشرفت های اخیر در واکنش زنجیره پلیمراز راهکار جدیدی را برای جهش زایی هدفمند بدست می دهد. هو و همکاران در سال 1989 روشی موسوم به بسطهمپوشی توسعه دادند که در آن چهار الیگونوکلئوتید بعنوان پرایمر به کارگرفته می شود.
دو پرایمر از این چهار پرایمر که دربرگیرنده جهش یافته می باشد مکمل همدیگر می باشند. دو پرایمر دیگر نیز مکمل رشته مقابل رئوس ژن های کلون شده می باشند.واکنش های زنجیره پلیمراز سه بار اجرا می شوند. دو واکنش نخست زنجیره پلیمراز با استفاده از یک پرایمر انتهایی و یک پرایمر جهش یافته در هر واکنش انجام می پذیرد. . محصولات مورد نظر دربرگیرنده دو دی ان ای دو رشته ای می باشد که هر کدام از یکی از راس ها امتداد یافته و در نقطه جهش زایی به هم می رسند. بهعبارت دیگر، دو محصول دی ان ای در منطقه جهش یافته باهم همپوشی می یابند.
محصولات واکنش زنجیره پلیمراز خالص سازی شده و بعنوان الگوهایی برای واکنش بین زنجیره پلیمراز سوم با دو راس پرایمر به کار گرفته می شوند. این امر طول کاملدی ان ای با جهش مورد نظر را بوجود می آورد.
مزیت این روش این است که می تواند با کارآیی تقریبا 100 درصد بطور سریع انجام پذیرد. پس از غربالگری و انتخاب، جهش زایی معمولا با توالی دی ان ای تایید میشود. پس از تایید، جهش یافته می تواند مجددا به منظور آزمایش تاثیر جهش زایی بر روی فعالیت آنزیم به یک وکتور بیان کلون تبدیل شود.
طی دهه اخیر، جهش زایی هدفمند به فرآیندی جزئی تبدیل شده است، بطوریکه مشکل زا ترین بخش پروژه تحقیقات مهندسی پروتئین بدون شک تعیین علت تغییر خواص یک پروتئین جهش یافته می باشد.
جهش زایی هدفمند به منظور تغییرفعالیت وپایداری آنزیم ها و همچنین تغییر ویژگی و تنظیم غیر تصادفی ژنهای نشانگر مستقل در ماده زمینه مورد استفاده قرار گرفته است. بطوریکه بیشتر آنزیم پاک کنندگی بیولوژیکی که در آمریکا(سالانه معادل 200 میلیون دلار) فروخته میشود از نوع پروتئین مهندسی شده تغییر یافته ازآنزیم بومی می باشد.
مرحله اول جهش زایی هدفمند کلون کردن ژن به پروتئین به منظور بررسی آن بصورت یک وکتور می باشد. این عملیات تفصیلی در بخش دیگری از این کتاب مورد بحث و بررسی قرار می گیرد. در مرحله بعدی، یک اولیگونوکلئوتید طراحی و ترکیب داده می شود.
این اولیگونوکلئوتید یک جهش مطلوبی خواهد داشت DNA که در مرکز واقع بوده و بوسیله توالیهای DNA که مکمل یک منطقه ویژه مورد نظر هستند، احاطه میشود. بنابراین، اولیگونوکلئوتید به منظور پیوند دادن تنها یک منطقه از ژن مورد نظر طراحی می شود. جهش سپس میتواند از طریق دورگ سازی اولیگونوکلئوتید باالگوی تک رشتهای به درون ژن انتقال داده می شود.
الگوهای تک رشته ای ژن مورد نظر ممکن است یا از طریق کلون کردن ژن به یک وکتور تک رشتهای از قبیلباکتریوفاژ ، یا با استفاده از فاگمیدها(یک پلاسمید کژزاد که درگیرنده یک منشا رونوشتی از باکتریخوار رشته ای که تک رشته ای بوسیله یک DNA هدایت ترکیب یک باکتریوفاژ کمک کننده را بر عهده دارد) حاصل شود . یک روش دیگر برای تولید الگوی تک رشتهای می تواند از طریق هضم DNA دو رشتهای با اگزونوکلئاز III پسازایجاد شکاف در یکی از رشته های DNA هدف با DNase یا یک اندونوکلئاز محدودکننده عملی شود.
ترکیب رشته دوم با دی ان ای پلیمراز با بهره گیری از اولیگونوکلئوتید بعنوان یک پرایمر صورت می پذیرد، و دی ان ای می تواند با دی ان ای لیگاز دایره ای شود. وکتوری که حامل دی ان ای نوترکیب می باشد(که در آن یک رشته جهش یافته است)میتواند به درون یک میزبان باکتریایی انتقال داده شودکه در آنجا بدلیل کپی شدن دی ان ای در
یک حالت نیمه حفاظتی، انتظار می رود که نیمی از سلولهای جدیدا ترکیب شده و حاوی دی ان ای دارای جهش باشد. پلیمریزاسیون دی ان ای نارس، اصلاح عدمتطبیق دی ان ای و ترکیب جابجا شدگی رشته عملا موجب عملکرد بسیار پایین جهش یافته ها می شود.
استراتژیهای مختلفی برای رسیدن به سطح بالاتری از کارایی جهشی با هدف کمینه سازی غربالگری جهش یافته توسعه داده شده اند. همزمان با الیگونوکلئوتیدهدفمند،الیگ ونوکلئوتید موتاژن دیگری که در برگیرنده یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک فعال می باشد میتواند وارد شود. در نتیجه پلاسمید نوع وحشی در یک محیطانتخابگر آنتی بیوتیک از بین خواهد رفت.
علاوه بر این، وارد ساختن اولیگونوکلئوتید موتاژنی دیگر می تواند موجب از بین رفتن یک اندونوکلئاز محدودکننده منحصر بفرد در رشته جهش یافته شود .
از این رو، پلاسمید نوع وحشی می تواند با این اندونوکلئاز محدودکننده منحصربفرد خطی سازی شود، بطوریکه پلاسمید جهش یافته دایرهای می تواند به میزبانباکتریایی تبدیل شود. روش جایگزین دیگر، اجرای بسط رشته دوم در حضور 5-متیل -دئوکسی سیتوزین تری فسفات می باشد که موجب مقاومت تعدادی از آنزیم های
محدودکننده در رشته جهش یافته میشود.
دی ان ای الگو سپس می تواند بوسیله این آنزیم هابرش سطحی شود، که بدنبال آن به منظور افزایش کارآیی جهش زایی هضم با اگزونوکلئاز 3 صورت می پذیرد.
پیشرفت های اخیر در واکنش زنجیره پلیمراز راهکار جدیدی را برای جهش زایی هدفمند بدست می دهد. هو و همکاران در سال 1989 روشی موسوم به بسطهمپوشی توسعه دادند که در آن چهار الیگونوکلئوتید بعنوان پرایمر به کارگرفته می شود.
دو پرایمر از این چهار پرایمر که دربرگیرنده جهش یافته می باشد مکمل همدیگر می باشند. دو پرایمر دیگر نیز مکمل رشته مقابل رئوس ژن های کلون شده می باشند.واکنش های زنجیره پلیمراز سه بار اجرا می شوند. دو واکنش نخست زنجیره پلیمراز با استفاده از یک پرایمر انتهایی و یک پرایمر جهش یافته در هر واکنش انجام می پذیرد. . محصولات مورد نظر دربرگیرنده دو دی ان ای دو رشته ای می باشد که هر کدام از یکی از راس ها امتداد یافته و در نقطه جهش زایی به هم می رسند. بهعبارت دیگر، دو محصول دی ان ای در منطقه جهش یافته باهم همپوشی می یابند.
محصولات واکنش زنجیره پلیمراز خالص سازی شده و بعنوان الگوهایی برای واکنش بین زنجیره پلیمراز سوم با دو راس پرایمر به کار گرفته می شوند. این امر طول کاملدی ان ای با جهش مورد نظر را بوجود می آورد.
مزیت این روش این است که می تواند با کارآیی تقریبا 100 درصد بطور سریع انجام پذیرد. پس از غربالگری و انتخاب، جهش زایی معمولا با توالی دی ان ای تایید میشود. پس از تایید، جهش یافته می تواند مجددا به منظور آزمایش تاثیر جهش زایی بر روی فعالیت آنزیم به یک وکتور بیان کلون تبدیل شود.
طی دهه اخیر، جهش زایی هدفمند به فرآیندی جزئی تبدیل شده است، بطوریکه مشکل زا ترین بخش پروژه تحقیقات مهندسی پروتئین بدون شک تعیین علت تغییر خواص یک پروتئین جهش یافته می باشد.