nafise sadeghi
18th May 2009, 01:52 AM
تکنيک‌هاي تهیه و توليد کشت آگار: (http://alonefarmer.blogfa.com/post-1970.aspx)
مقدمه
هوايي كه از آن تنفس مي‌كنيم مملو از موجودات بسيار ريز است كه با باد به حركت درمي‌آيند. قارچ‌ها، باكتريها، ويروسها و گياهان براي انتقال گرده‌هاي خود به مناطق ديگر از باد كمك مي‌گيرند. در صورت عدم رعايت نكات بهداشتي، اين ذرات مي‌توانند چه در تهيه كشت خالص و چه در فرآيند توليد قارچ خوراكي خلل وارد نمايند.
به طور كلي منابع اصلي آلاينده محيط كشت عبارتند از
1. محيط اطراف
2. ظروف كشت
3. ادوات و ابزار کشت
4. پرورش دهنده و لباس وي
5. هاگها يا ميسليوم قارچ خوراكي
قارچ‌ها و تمامي موجودات زنده نسبت به مواد غذايي، رقابت تنگاتنگ و دائمي با يكديگر دارند. هدف از ايجاد يك محيط استريل، حذف يا كاهش اين گونه رقابت و در نهايت فراهم ساختن شرايط مناسب براي تكثير قارچ خوراكي مي‌باشد. اولين مرحله قبل از تهيه كشت خالص، احداث اطاقک تلقيح يا آزمايشگاه استريل است.
طراحي و احداث آزمايشگاه استريل
علت عمده شكست بيشتر پرورش‌دهندگان قارچ، عدم صرف وقت كافي به منظور احداث آزمايشگاه استريل است. كاري كه چندان هم وقت و انرژي نمي‌برد، بلكه فقط يك و نيم روز كافي است تا يك انباري كوچك يا يك آبدارخانه را به يك اطاقک تلقيح مفيد تبديل نمود.
براي شروع تمام قاليچه‌ها، پتوها، پرده‌ها و ديگر مواد پارچه‌اي را كه پناهگاه خوبي براي گرد و غبار و هاگهاي مضر می باشند از محل دور كرده و تمامي ديوارها و سقف را با يك ماده ضد عفوني كننده كاملاً تميز نمائيد. اطاق را با يك رنگ روغني براق يا اپوكسي بهداشتي رنگ زده تا شستشو‌هاي بعدي راحت‌تر گردد. پنجره‌ها يا هر منبع ورودي هوا را با يك پوشش پلاستيكي مناسب بپوشانيد. محل ورودي اطاق را با پلاستيك يا هر ماده ديگر بصورت يك محفظه انتظار درآورده تا مانع جريان مستقيم هوا بدرون اطاق گردد و طراحي اين محفظه بايد به گونه‌اي باشد كه هنگام ورود به آن؛ درب آزمايشگاه بسته باشد.
تجهيزات ذيل در هر آزمايشگاه ضروري است:
1- صندلي و ميز محكم با سطح كاملاً صاف
2- چراغ الكلي، چراغ بنسن يا يك شعله معمولي گاز بوتان براي توليد حرارت
3- بطري اسپري حاوي محلول سفيد كننده 10 درصد
4- تعدادي پتري ديش استريل و لوله آزمايش
5- تعدادي برچسب ، يك دفتر و خودكار
6- يك چاقوي آگار و حلقه تلقيح
7- يك دستگاه اتوكلاو يا زودپز معمولي (بخار تحت فشار)
8- pH سنج يا كاغذ تورنسل معمولي
9- الكل 96 درصد و ديگر مواد ضد عفوني همچون وايتكس، فرمالين…
10- قفسه براي ظروف كشت، جالوله‌اي و…
تمامي اين اجزاء بايستي درون آزمايشگاه بماند و در صورت خروج يكي از آنها به بيرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمايشگاه بايد از تميز بودن آن، مطمئن شد.
به طور كلي براي طراحي يك آزمايشگاه بايد علاوه بر تجهيزات و وسايل گفته شده اصول زير نيز درنظر گرفته شود.
— اطاق تهيه محيط كشت كه داراي تجهيزات كامل و قفسه‌هاي متعدد است (35 درصد مساحت كل)
— اطاقك شيشه‌اي استريل (محفظه تلقيح)(15 درصد مساحت كل)
— اتاق كشت (40 درصد مساحت كل)
— الباقي مساحت براي نگهداري وسايل، اتوكلاو، ترازوها، يخچال و انبار ميسليوم
و اسپان مادري (حدوداً 10 درصد)
با روش ساده‌اي مي‌توان آزمايشگاه يا محيطي نيمه استريل بسته به حجم استفاده و دفعات كاري ايجاد نمود. درصد پاكي لازم براي اطاق استريل تابع مقدار هاگ محيط بيرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاينده‌هاي هوا تا حد زيادي كاهش يافته، حال آن كه در طول تابستان و بهار اين مقدار بسيار زياد مي‌باشد. بنابراين لازم است در طي اين دو فصل توجه كافي به استريل بودن محيط آزمايشگاه مبذول گردد. نكته مهم ديگر اين كه، تمامي ظروف و بطري‌هاي شيشه‌اي آلوده را بايد به طريقي از بين برد تا ضريب آلودگي محيط آزمايشگاه به حداقل برسد.
بعد از احداث اطاق استريل بايد يك سري اصول و نكات بهداشتي را كاملاً رعايت نمود. به اين صورت كه اطاق استريل را بايد با يك محلول سفيدكننده (آب ژاول) كاملاً تميز نمود؛ كف را طي كشيده و در پايان هواي اطاق را با يك محلول سفيد كننده 10 درصد و با استفاده از يك سمپاشي پشتي يا اسپري ضدعفوني نمائيم. حداقل تا 15 دقيقه بعد از محلول پاشي نبايد وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقيح و كشت اين عمليات بايد تكرار شود، چرا كه همواره پيشگيري آسانتر و بهتر از درمان است.
پيش از ادامه بحث، ذكر چند نكته ضروري است. استريل نمودن و استريل نگاه داشتن محيط مستلزم توجه زياد همراه با كمك و ياري مداوم ديگران است. اين امر وقت‌گير بوده و نبايد سرسري و مقطعي انجام گيرد. هرگز يك چراغ الكلي يا شعله گاز را درون اطاق يا محفظه تلقيح روشن نگذاريد، چرا كه در يك محيط بسته اكسيژن هوا به زودي تمام مي‌شود.
بعضي از پرورش‌دهندگان، بيش از نياز لازم بهداشتي با آلودگي مقابله مي‌نمايند. بدين ترتيب اين افراد آزمايشگاه و در نهايت سلامتي خود را با مصرف وسواسي و افراطي قارچ‌كشها، باكتري‌كشها و ضدعفوني كننده‌هاي شيميائي جهش‌زاي خطرناك به خطر مي‌اندازند. به طور مثال مي‌توان به عوارضي همچون تنگي نفس، بي‌حسي‌هاي شديد همراه با تشنج‌هاي مداوم كه گاه تا چندين روز نيز به درازا مي‌انجامد كه بر اثر كار طولاني مدت افراد، بلافاصله در اطاق‌هائي كه مدت چنداني (كمتر از 15 دقيقه) از سمپاشي آنها بالاخص با سموم فنلي نگذشته اشاره كرد و يا از بين موارد متعدد ديگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولاني (چند سال) و مستقيم پوست (بدون پوشش ايمني) با اشعه ماوراي بنفش (uv) در حين استريل كردن نمونه‌ها داخل محفظه شيشه‌اي درون اطاق تلقيح اشاره نمود.
چنانچه عليرغم تلاش فراوان در جهت استريل نمودن محيط آلودگي باز هم در محيط باقي بماند در آن صورت مي‌توان از راه‌كارهاي ذيل استفاده نمود.
1. بخوردادن روغن استريل‌كننده مانند تري‌اتيلن گلايکول با‌گرم‌كن‌فتيله‌اي در‌فضاي اطاق كه ابري از قطرات بسيار ريز و نسبتاً سنگين در هوا ايجاد شده كه ضمن پائين آمدن ذرات آلاينده معلق در هوا را جذب كرده و از بين مي‌برند. ذرات اين روغن نسبتاً ريز و فرار بوده و هيچ گونه لايه قابل مشاهده‌اي در فضا ايجاد نمي‌نمايد. اين روش ارزان و آسان مي‌باشد.
2. احداث نوعي محفظه شيشه‌اي كاملاً مسدود و نيمه استريل براي نقل و انتقال و كارهاي كشت بافت كه مي‌توان آنها را از چوب و پنجره‌اي كوچك براي نگاه كردن درون آن ساخت كه در يك طرف آن دو سوراخ لاستيكي مخصوص تعبيه مي‌نمايند تا هنگام كار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه كرده و در صورت عدم استفاده، ورودي سوراخ‌ها با لفافه‌اي پوشيده مي‌شود. مزيت عمده اين محفظه ارزان، بودن استريل كردن آسان محيط داخل آن و عدم جريان مستقيم هوا به درون آن در ضمن كار مي‌باشد.
3. استفاده از صافي‌هاي بسيار ريز كه قطر چشمه‌هاي آن 3/0-1/0 ميكرون بوده و از قطر هاگهاي مضر بعضي قارچ‌ها و حتي از باكتريها نيز كوچكتر است. از اين صافي‌ها در سامانه‌هاي مخصوصي بنام هود تهويه ملايم استفاده مي‌نمايند. در برخي از آزمايشگاه‌هاي پيشرفته تمام استريل، درون ديوارها يا سقف نيز از اين نوع صافي‌ها استفاده شده و هواي ورودي اطاق با عبور از ميان آنها تصفيه مي‌شود.
براي كسب اطلاعات بيشتر به ضميمه چهارم مراجعه شود
آلودگي، ممكن است در يك محل كم و در جاي ديگر زياد باشد و يا در يك مرحله از پرورش طغيان نمايد يا اين كه عليرغم چند سال فعاليت، اثري از آن ديده نشود. از طرفي بايد توجه داشت كه نوع آلودگي، در مراحل و مكان‌هاي مختلف يكسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به يك سري عوامل مختلف داخلي يا محيطي متفاوت است كه با اعمال يك سري تمهيدات و اصول بهداشتي تا حدي مي‌توان آن را كنترل نمود.
شكل 19- دستگاه تصفيه‌کننده هوا براي كاهش شكل 20- هود تهويه ملايم هوا
ميزان هاگ آلاينده درون آزمايشگاه
آماده کردن محيط کشت
پس از تكميل آزمايشگاه نوبت به تهيه محيط كشت مغذي آگار مي‌رسد. آگار، محصولي است كه از نوعي جلبك دريايي بدست آمده و براي سفت كردن محيط كشت بكار مي‌رود و از نظر ظاهري بسيار شبيه ژلاتين است اما از نظر كاركرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمينه توليد محيط كشت آگار غني شده كه مناسب قارچ‌هاي خوراكي باشد، فرمول‌هاي متعددي وجود دارد كه از اين ميان مي‌توان به فرمول‌هاي استاندارد PDA وMEA همراه با مكمل خميرمايه اشاره نمود. در بسياري از مجلات قارچ شناسي، فهرستي از انواع محيط‌هاي كشت آگار حاوي پپتن و نئوپپتن (دو منبع سرشار از پروتئين مورد نياز ميسليوم) ارائه شده است. محيط كشتي كه مؤلفان توصيه مي‌نمايند، مخلوطي از دانه‌هاي جوشانده شده گندم يا چاودار غني شده با شيره مالت است. براي افزايش رشد مي‌توان به محيط كشت زايلوز و 1- آرابينوز (از قندهاي پنج كربنه پنتوزي متبلور) اضافه كرد. از جمله مواد لازم ديگر براي محيط كشت مي‌توان كلسيم، بيوتين، تيامين، اسيدهاي آمينه اسپاراژين، آلانين و گلايزين را نام برد.
آنچه در ادامه‌مي‌بينيد سه نوع فرمول مغذي آگار است كه هر كدام از آنها براي رشد ميسليومهاي انواع مختلف قارچ خوراكي همچون دكمه‌اي، صدفي، شي‌تاكه، استروفاريا، چيني، پانالوس و سيلوسب استفاده مي‌شود كه از بين آنها؛ 2 محيط PDY و MPG مورد توجه مؤلفان اين كتاب مي‌باشند. توصيه مي‌شود براي افزايش رشد ميسليومها به هر محيط، مقداري پودر چاودار و يا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر يك از فرمول‌هاي زير تركيبات آن را بصورت خشك با هم مخلوط كرده، درون يك فلاسك ريخته و درنهايت با افزودن آب، حجم مخلوط را به يك ليتر برسانيد.
شكل 21- محفظه شيشه‌اي استاندارد.
الف) آگار PDY (مخمر دكستروز سيب‌زميني)
ـ عصاره صاف شده 300 گرم خلال سيب‌زميني كه در يك ليتر آب تا يك ساعت جوشيده باشد.
ـ 10 گرم قند (گلوكز راست گرد) (قند دکستروز)
ـ 2 گرم مخمر (اختياري)
- 20 گرم آگار
ب) آگار MPG (مخلوط بذرـ پپتين ـ مالت)
ـ 20 گرم مالت عسلي رنگ
ـ 5 گرم پودر بذر چاودار
ـ 5 گرم پپتين يا نئوپپتن
ـ 2 گرم مخمر (اختياري)
ـ 20 گرم آگار
ج) آگار MEA (آگار عصاره مالت)
ـ 20 گرم مالت عسلي رنگ
ـ 2 گرم مخمر
ـ 20 گرم آگار
در تهيه محيط كشت، رعايت نكات زير ضروري است
1. pH محيط كشت: گونه‌هاي متفاوت قارچ براي رشد و نمو در محيط كشت، pH خاص خود را مي‌طلبند. بطوري كه pH مطلوب براي گونه‌هاي سيلوب 7-6 مي‌باشد؛ در حالي كه اين مقدار براي نوع دکمه‌اي 7-5/6 مي‌باشد. اكثر گونه‌ها، نسبتاً مقاوم بوده و بخوبي در دامنه 5/7 –5/5 رشد مي‌نمايند. pH كمتر از 5/4 و بالاتر از 7 باعث توقف رشد و نمو (هاگها و ميسليومها) مي‌گردد و چنانچه pH محيط خيلي پائين باشد. محيط كشت رقيق مي‌شود و بايد محيط تازه با pH مطلوب آماده شود. pH ، بعد از اتوكلاو كردن تا 4/0 واحد كاهش مي‌يابد.
چنانچه در حين تهيه محيط كشت، pH خيلي پائين يا بالا رود، مي‌توان بترتيب آن را با Naoh يا Hcl (1 تا 1/0 مولار) رقيق، تعديل كرده سپس محيط كشت را كاملاً هم زده و سپس pH آن را با يك pH سنج يا كاغذ تورنسل معمولي مي‌سنجيم ( pH يك مول Hcl ، صفر؛ يك مول Naoh =12 و يك مول آب مقطر= 7 است).
2.ضدعفوني محيط كشت: اين كار معمولاً به دو روش صورت مي‌گيرد.
الف: با مواد شيميائي: مانند الكل 70درصد؛ هيپوكلريت سديم (وايتكس) 1درصد و بالاخص آنتي‌بيوتيكها. در هر صورت ساده‌ترين راه، استفاده از مواد گياهي غير آلوده است. جهت كنترل باكتريها در محيط كشت، 1/0 گرم از محلول سولفات جنتامايسين 80-60درصد را قبل از عمل اتوكلاو كردن بايد به هر ليتر از اين محيط‌ها اضافه نمود. همچنين مي‌توان از نوع ديگر آنتي‌بيوتيك بنام استرپتومايسين بعد از استريل كردن محيط كشت استفاده كرد. در مجموع بايد از آنتي‌بيوتيكها بصورت موقتي و به مقدار بسيار اندك بهره جست چون غلظت بالاي آنها، مانع رشد و نمو بعضي گونه‌ها و از طرف ديگر ايجاد مقاومت در باكتريها مي‌شود.
ب) با بخار: بعد از اختلاط كامل تركيبات محيط كشت و در صورت باقي ماندن اثرات باكتري بعد از ضدعفونيِ شيميائي (آنتي‌بيوتيكها) مي‌توان براي رفع هر گونه آلودگي با بخار تحت فشار، محيط كشت را استريل و يا به اصطلاح اتوكلاو نمود. استريل كردن صحيح، بستگي به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استريل دارد. در شرايط عادي مي‌توان محيط كشت آماده را داخل ارلن پيركس (به علت دهانه تنگ آن ميزان تهويه، خشك شدن و ضريب آلودگي كاهش مي‌يابد) ريخته درب آن را با يك فويل آلومينيومي پوشاند. دقت كنيد كه حجم آگار درون ارلن نبايد از http://www.blogfa.com/Desktop/Image3.gif تا http://www.blogfa.com/Desktop/Image4.gif حجم كل ظرف بيشتر شود.
ظرف كشت را داخل اتوكلاو يا زودپز معمولي قرار داده و ته زودپز را يك سانتي‌متر آب مقطر بريزيد تا بخار لازم تأمين شود. طبق دستورالعمل شركت سازنده، درب زودپز را كاملاً بسته آن را حرارت دهيد تا بخار فراوان توليد نمايد. قبل از بستن سوپاپ اطمينان بخار، بگذاريد تا بخار آن به مدت 4 تا 5 دقيقه خارج شود. به آرامي فشار را به 15 پوند رسانده و 30 دقيقه در همين فشار نگهداريد. توجه كنيد دماي ظرف از 121 درجه سانتی گراد فراتر نرود، چه در غير اين صورت قند موجود در محيط كشت، سوخته و به اصطلاح كارامل مي‌شود كه در نتيجه آن؛ رشد ميسليوم متوقف شده، يكسري جهش‌هاي ناخواسته ژنتيكي پديدار مي‌شود. از طرفي اتوكلاو كردن بيش از 30 دقيقه باعث ته‌نشين شدن املاح مفيد (بخصوص k+ ) و تجزيه آگار مي‌شود. هم چنين بايد ظروف خالي شيشه‌اي و كاغذها را بطور جداگانه به مدت 30 دقيقه در دماي 130 سانتي‌گراد (بصورت خشك) استريل نمود.
نكته حائز اهميت ديگر در مورد اتوكلاو كردن، اين كه زمان لازم براي اين عمل بسته به ارتفاع از سطح دريا، متفاوت است. طبق قانون بويل ـ ماريوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقيمي با يكديگر دارند. فشار هوا را معمولاً نسبت به سطح استاندارد دريا محاسبه نموده و هر چه از سطح دريا بالاتر مي‌رويم فشار هوا كمتر مي‌شود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دريا، بايد فشار اتوكلاو يا زودپز را افزايش دهيم تا خللي در عمل استريليزاسيون وارد نشود. ذيلاً نسبت‌هاي بين پارامترهاي دما، فشار هوا، و تغييرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذيل مي‌بينيد. بعنوان مثال در ارتفاع حدوداً 1500 متري از سطح دريا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دريا تقريباً 5/4 -5 درجه سانتي‌گراد كاهش مي‌يابد (C˚95) و از طرفي در اين ارتفاع؛ فشار هوا 5 پوند يا تقريباً 4/0 اتمسفر نسبت به سطح دريا افزايش مي‌يابد (4/1 اتمسفر) در نتيجه با توجه با اين كه نبايد دماي داخل اتوكلاو را (به سبب بروز تغييرات شيميائي مواد داخل آن) افزايش دهيم، بناچار مجبوريم، فشار را به ميزان 4/0 آتمسفر (5 پوند) بالا ببريم تا جبران 5 اختلاف دما را در اين ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوكلاو بنمايد.
جدول1-2- رابطه بين ارتفاع و نقطه جوش و نيز فشار و دما
رابطه ارتفاع و نقطه جوش
رابطه فشار- دما در حجم ثابت
نقطه جوش
ارتفاع ازسطح دريا(متر)
فشارKg/cm2
(سانتی گراد) دما
100
در سطح دريا
07/0
100
99
307
2/0
104
98
619
3/0
108
97
5/934
7/0
115
96
1250
=1atm05/1
121
95
1567
5/1
126
93
1892
75/1
130
توجه كنيد استريليزاسيون در فشار 05/1 kg/cm2 به مدت يك ساعت داراي نتايج مشابهي با استريليزاسيون در فشار kg/cm22 به مدت 30 دقيقه (يعني دوبرابر كردن فشار و نصف كردن مدت زمان) دارد؛ منتها مسأله مهم در اين جا اين است كه اكثر زودپزها تحمل اين فشار را ندارند كه بايد حتماً قبل از استفاده به برچسب كنترل كيفي روي هر زودپز توجه شود.
بعد از اتمام استريل كردن؛ زودپز را در آزمايشگاه يا يك اطاق نيمه استريل قرار داده، اجازه دهيد تا قبل از باز كردن درب آن، فشار به يك پوند (07/0kg/cm2) كاهش يابد. سپس درب آن را باز نمائيد و اقدام به ريختن آگار در پتري ديش‌ها نمائيد. بايد دانست با هر ليتر از محلول آگار بدست آمده مي‌توان 30 پتري ديش 15×100 ميلي‌متر را پر نمود. چنانچه با محدوديت فضاي ميزكار مواجه هستيد، مي‌توانيد پتري ديش‌ها را پس از پر نمودن يك به يك روي هم بگذاريد اما در‌غير اين صورت مي‌توانيد هر يك از پتري ديش‌ها را در كنار هم قرار دهيد و دامنه كار خود را توسعه دهيد (شکل 22و23).
شكل 22 و 23- نحوه ريختن آگار در پتري ديش‌ها – سمت چپ: روش چیدن عمودی پتری دیشهای پر شده (ميز کار کوچک)؛ در سمت راست چیدن پتری دیشهای پر شده در کنار هم دیگر (ميز کار بزرگ).
پيش از پر نمودن پتري ديش‌ها، محلول كشت را به شدت تكان دهيد تا محتويات آن خوب پخش شده مخلوطي همگن بدست آيد. سپس بگذاريد تا آگار خنك شده و يكنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتري ديش‌ها نمائيد تا بدين وسيله از تعريق جدار داخلي ظروف كه از ريختن محلول آگار گرم ناشي مي‌شود، جلوگيري شود.
حال، اين محلول آماده كشت هاگ يا بافت زنده مي‌باشد كه در ادامه روش آنرا خواهيم ديد.
كشت هاگ
كشت خالص به منظور تهيه اسپان مورد نياز براي تكثير قارچ خوراكي را به دو روش مي‌توان تهيه نمود. كشت هاگ، كه به نوعي مي‌توان آن را تكثير جنسي ناميد و داراي تفريق صفات و تنوع بالاي نتاج حاصله از نظر كيفيت و كميت محصول مي‌باشد. از اين روش بيشتر براي تهيه بذر قارچ استفاده مي‌شود. روش دوم كشت بافت زنده يا به اصطلاح تكثير غيرجنسي و يا كلونينگ مي‌باشد. اين روش به علت شباهت بالاي نتاج توليدي با والدين؛ بيشتر در تكثير قارچ‌هائي كه از نظر كيفيت و كميت محصول در حد مطلوبي هستند استفاده مي‌شود.
پرورش دهندگان قارچ، كشت هاگ را بدليل راحتي اجرا و ماندگاري بالاي هاگها حتی تا ماهها بعد از تجزیه کلاهکها ترجيح مي‌دهند. اما ماندگاري كلاهكها يا بافت زنده بسيار كم است (1 تا 2 روز) و بايد بلافاصله بعد از چيدن بافت، اقدام به كشت نمود.
گرفتن نقش هاگ
مرحله اول در كشت هاگ؛ جمع‌آوري مقداری هاگ (نقش اسپور) از قارچ‌هاي سالم و مناسب مي‌باشد. بدين منظور كلاهك سالم، تازه و كاملاً تميزي را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روي يك كاغذ سفيد يا سطح شيشه‌اي تميز (اسلايد ميكروسكوپ) يك تا دو ساعت مي‌گذاريم. چنانچه كلاهك موردنظر خشك باشد، جهت رهاسازي آسانتر هاگ يكي دو قطره آب مقطر به آن زده و براي جلوگيري از كاهش تبخير و جريان هواي مستقيم، يك بشر بر روي آن مي‌گذاريم. پس از چند ساعت كه هاگها، كاملاً رها شد و نقش تيغه‌ها روي كاغذ افتاد؛ كاغذ هاگها را بريده از وسط تا مي‌زنيم و دريك ظرف كاملاً در بسته گذاشته وروي آن را بر چسبي حاوي زمان جمع‌آوري؛ گونه قارچ و شماره جمع‌آوري مي‌زنيم. در صورت جمع‌آوري هاگها روي لامل ميكروسكوپ، كافيست هاگها را ما بين دو لامل قرار داده دور تا دور لبه اين دو لامل را با نوار چسب بچسبانيم تا از نفوذ هاگهاي آلاينده، ايمن شود. در صورتي كه در جمع‌آوري و نگهداري هاگها دقت كافي نشود، محيط كشت هاگ آلوده شده و امكان به دست آوردن يك كشت خالص كاهش مي‌يابد. (شکل 24 الف)
شكل 24 الف- جمع آوري هاگها بر روي كاغذ سفيد تايپ (نقش هاگ).
شكل 24 ب- گرفتن نقش هاگ برروي پتري ديش و لامل ميکروسکوپ
http://alonefarmer.blogfa.com/post-1970.aspx
مقدمه
هوايي كه از آن تنفس مي‌كنيم مملو از موجودات بسيار ريز است كه با باد به حركت درمي‌آيند. قارچ‌ها، باكتريها، ويروسها و گياهان براي انتقال گرده‌هاي خود به مناطق ديگر از باد كمك مي‌گيرند. در صورت عدم رعايت نكات بهداشتي، اين ذرات مي‌توانند چه در تهيه كشت خالص و چه در فرآيند توليد قارچ خوراكي خلل وارد نمايند.
به طور كلي منابع اصلي آلاينده محيط كشت عبارتند از
1. محيط اطراف
2. ظروف كشت
3. ادوات و ابزار کشت
4. پرورش دهنده و لباس وي
5. هاگها يا ميسليوم قارچ خوراكي
قارچ‌ها و تمامي موجودات زنده نسبت به مواد غذايي، رقابت تنگاتنگ و دائمي با يكديگر دارند. هدف از ايجاد يك محيط استريل، حذف يا كاهش اين گونه رقابت و در نهايت فراهم ساختن شرايط مناسب براي تكثير قارچ خوراكي مي‌باشد. اولين مرحله قبل از تهيه كشت خالص، احداث اطاقک تلقيح يا آزمايشگاه استريل است.
طراحي و احداث آزمايشگاه استريل
علت عمده شكست بيشتر پرورش‌دهندگان قارچ، عدم صرف وقت كافي به منظور احداث آزمايشگاه استريل است. كاري كه چندان هم وقت و انرژي نمي‌برد، بلكه فقط يك و نيم روز كافي است تا يك انباري كوچك يا يك آبدارخانه را به يك اطاقک تلقيح مفيد تبديل نمود.
براي شروع تمام قاليچه‌ها، پتوها، پرده‌ها و ديگر مواد پارچه‌اي را كه پناهگاه خوبي براي گرد و غبار و هاگهاي مضر می باشند از محل دور كرده و تمامي ديوارها و سقف را با يك ماده ضد عفوني كننده كاملاً تميز نمائيد. اطاق را با يك رنگ روغني براق يا اپوكسي بهداشتي رنگ زده تا شستشو‌هاي بعدي راحت‌تر گردد. پنجره‌ها يا هر منبع ورودي هوا را با يك پوشش پلاستيكي مناسب بپوشانيد. محل ورودي اطاق را با پلاستيك يا هر ماده ديگر بصورت يك محفظه انتظار درآورده تا مانع جريان مستقيم هوا بدرون اطاق گردد و طراحي اين محفظه بايد به گونه‌اي باشد كه هنگام ورود به آن؛ درب آزمايشگاه بسته باشد.
تجهيزات ذيل در هر آزمايشگاه ضروري است:
1- صندلي و ميز محكم با سطح كاملاً صاف
2- چراغ الكلي، چراغ بنسن يا يك شعله معمولي گاز بوتان براي توليد حرارت
3- بطري اسپري حاوي محلول سفيد كننده 10 درصد
4- تعدادي پتري ديش استريل و لوله آزمايش
5- تعدادي برچسب ، يك دفتر و خودكار
6- يك چاقوي آگار و حلقه تلقيح
7- يك دستگاه اتوكلاو يا زودپز معمولي (بخار تحت فشار)
8- pH سنج يا كاغذ تورنسل معمولي
9- الكل 96 درصد و ديگر مواد ضد عفوني همچون وايتكس، فرمالين…
10- قفسه براي ظروف كشت، جالوله‌اي و…
تمامي اين اجزاء بايستي درون آزمايشگاه بماند و در صورت خروج يكي از آنها به بيرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمايشگاه بايد از تميز بودن آن، مطمئن شد.
به طور كلي براي طراحي يك آزمايشگاه بايد علاوه بر تجهيزات و وسايل گفته شده اصول زير نيز درنظر گرفته شود.
— اطاق تهيه محيط كشت كه داراي تجهيزات كامل و قفسه‌هاي متعدد است (35 درصد مساحت كل)
— اطاقك شيشه‌اي استريل (محفظه تلقيح)(15 درصد مساحت كل)
— اتاق كشت (40 درصد مساحت كل)
— الباقي مساحت براي نگهداري وسايل، اتوكلاو، ترازوها، يخچال و انبار ميسليوم
و اسپان مادري (حدوداً 10 درصد)
با روش ساده‌اي مي‌توان آزمايشگاه يا محيطي نيمه استريل بسته به حجم استفاده و دفعات كاري ايجاد نمود. درصد پاكي لازم براي اطاق استريل تابع مقدار هاگ محيط بيرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاينده‌هاي هوا تا حد زيادي كاهش يافته، حال آن كه در طول تابستان و بهار اين مقدار بسيار زياد مي‌باشد. بنابراين لازم است در طي اين دو فصل توجه كافي به استريل بودن محيط آزمايشگاه مبذول گردد. نكته مهم ديگر اين كه، تمامي ظروف و بطري‌هاي شيشه‌اي آلوده را بايد به طريقي از بين برد تا ضريب آلودگي محيط آزمايشگاه به حداقل برسد.
بعد از احداث اطاق استريل بايد يك سري اصول و نكات بهداشتي را كاملاً رعايت نمود. به اين صورت كه اطاق استريل را بايد با يك محلول سفيدكننده (آب ژاول) كاملاً تميز نمود؛ كف را طي كشيده و در پايان هواي اطاق را با يك محلول سفيد كننده 10 درصد و با استفاده از يك سمپاشي پشتي يا اسپري ضدعفوني نمائيم. حداقل تا 15 دقيقه بعد از محلول پاشي نبايد وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقيح و كشت اين عمليات بايد تكرار شود، چرا كه همواره پيشگيري آسانتر و بهتر از درمان است.
پيش از ادامه بحث، ذكر چند نكته ضروري است. استريل نمودن و استريل نگاه داشتن محيط مستلزم توجه زياد همراه با كمك و ياري مداوم ديگران است. اين امر وقت‌گير بوده و نبايد سرسري و مقطعي انجام گيرد. هرگز يك چراغ الكلي يا شعله گاز را درون اطاق يا محفظه تلقيح روشن نگذاريد، چرا كه در يك محيط بسته اكسيژن هوا به زودي تمام مي‌شود.
بعضي از پرورش‌دهندگان، بيش از نياز لازم بهداشتي با آلودگي مقابله مي‌نمايند. بدين ترتيب اين افراد آزمايشگاه و در نهايت سلامتي خود را با مصرف وسواسي و افراطي قارچ‌كشها، باكتري‌كشها و ضدعفوني كننده‌هاي شيميائي جهش‌زاي خطرناك به خطر مي‌اندازند. به طور مثال مي‌توان به عوارضي همچون تنگي نفس، بي‌حسي‌هاي شديد همراه با تشنج‌هاي مداوم كه گاه تا چندين روز نيز به درازا مي‌انجامد كه بر اثر كار طولاني مدت افراد، بلافاصله در اطاق‌هائي كه مدت چنداني (كمتر از 15 دقيقه) از سمپاشي آنها بالاخص با سموم فنلي نگذشته اشاره كرد و يا از بين موارد متعدد ديگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولاني (چند سال) و مستقيم پوست (بدون پوشش ايمني) با اشعه ماوراي بنفش (uv) در حين استريل كردن نمونه‌ها داخل محفظه شيشه‌اي درون اطاق تلقيح اشاره نمود.
چنانچه عليرغم تلاش فراوان در جهت استريل نمودن محيط آلودگي باز هم در محيط باقي بماند در آن صورت مي‌توان از راه‌كارهاي ذيل استفاده نمود.
1. بخوردادن روغن استريل‌كننده مانند تري‌اتيلن گلايکول با‌گرم‌كن‌فتيله‌اي در‌فضاي اطاق كه ابري از قطرات بسيار ريز و نسبتاً سنگين در هوا ايجاد شده كه ضمن پائين آمدن ذرات آلاينده معلق در هوا را جذب كرده و از بين مي‌برند. ذرات اين روغن نسبتاً ريز و فرار بوده و هيچ گونه لايه قابل مشاهده‌اي در فضا ايجاد نمي‌نمايد. اين روش ارزان و آسان مي‌باشد.
2. احداث نوعي محفظه شيشه‌اي كاملاً مسدود و نيمه استريل براي نقل و انتقال و كارهاي كشت بافت كه مي‌توان آنها را از چوب و پنجره‌اي كوچك براي نگاه كردن درون آن ساخت كه در يك طرف آن دو سوراخ لاستيكي مخصوص تعبيه مي‌نمايند تا هنگام كار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه كرده و در صورت عدم استفاده، ورودي سوراخ‌ها با لفافه‌اي پوشيده مي‌شود. مزيت عمده اين محفظه ارزان، بودن استريل كردن آسان محيط داخل آن و عدم جريان مستقيم هوا به درون آن در ضمن كار مي‌باشد.
3. استفاده از صافي‌هاي بسيار ريز كه قطر چشمه‌هاي آن 3/0-1/0 ميكرون بوده و از قطر هاگهاي مضر بعضي قارچ‌ها و حتي از باكتريها نيز كوچكتر است. از اين صافي‌ها در سامانه‌هاي مخصوصي بنام هود تهويه ملايم استفاده مي‌نمايند. در برخي از آزمايشگاه‌هاي پيشرفته تمام استريل، درون ديوارها يا سقف نيز از اين نوع صافي‌ها استفاده شده و هواي ورودي اطاق با عبور از ميان آنها تصفيه مي‌شود.
براي كسب اطلاعات بيشتر به ضميمه چهارم مراجعه شود
آلودگي، ممكن است در يك محل كم و در جاي ديگر زياد باشد و يا در يك مرحله از پرورش طغيان نمايد يا اين كه عليرغم چند سال فعاليت، اثري از آن ديده نشود. از طرفي بايد توجه داشت كه نوع آلودگي، در مراحل و مكان‌هاي مختلف يكسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به يك سري عوامل مختلف داخلي يا محيطي متفاوت است كه با اعمال يك سري تمهيدات و اصول بهداشتي تا حدي مي‌توان آن را كنترل نمود.
شكل 19- دستگاه تصفيه‌کننده هوا براي كاهش شكل 20- هود تهويه ملايم هوا
ميزان هاگ آلاينده درون آزمايشگاه
آماده کردن محيط کشت
پس از تكميل آزمايشگاه نوبت به تهيه محيط كشت مغذي آگار مي‌رسد. آگار، محصولي است كه از نوعي جلبك دريايي بدست آمده و براي سفت كردن محيط كشت بكار مي‌رود و از نظر ظاهري بسيار شبيه ژلاتين است اما از نظر كاركرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمينه توليد محيط كشت آگار غني شده كه مناسب قارچ‌هاي خوراكي باشد، فرمول‌هاي متعددي وجود دارد كه از اين ميان مي‌توان به فرمول‌هاي استاندارد PDA وMEA همراه با مكمل خميرمايه اشاره نمود. در بسياري از مجلات قارچ شناسي، فهرستي از انواع محيط‌هاي كشت آگار حاوي پپتن و نئوپپتن (دو منبع سرشار از پروتئين مورد نياز ميسليوم) ارائه شده است. محيط كشتي كه مؤلفان توصيه مي‌نمايند، مخلوطي از دانه‌هاي جوشانده شده گندم يا چاودار غني شده با شيره مالت است. براي افزايش رشد مي‌توان به محيط كشت زايلوز و 1- آرابينوز (از قندهاي پنج كربنه پنتوزي متبلور) اضافه كرد. از جمله مواد لازم ديگر براي محيط كشت مي‌توان كلسيم، بيوتين، تيامين، اسيدهاي آمينه اسپاراژين، آلانين و گلايزين را نام برد.
آنچه در ادامه‌مي‌بينيد سه نوع فرمول مغذي آگار است كه هر كدام از آنها براي رشد ميسليومهاي انواع مختلف قارچ خوراكي همچون دكمه‌اي، صدفي، شي‌تاكه، استروفاريا، چيني، پانالوس و سيلوسب استفاده مي‌شود كه از بين آنها؛ 2 محيط PDY و MPG مورد توجه مؤلفان اين كتاب مي‌باشند. توصيه مي‌شود براي افزايش رشد ميسليومها به هر محيط، مقداري پودر چاودار و يا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر يك از فرمول‌هاي زير تركيبات آن را بصورت خشك با هم مخلوط كرده، درون يك فلاسك ريخته و درنهايت با افزودن آب، حجم مخلوط را به يك ليتر برسانيد.
شكل 21- محفظه شيشه‌اي استاندارد.
الف) آگار PDY (مخمر دكستروز سيب‌زميني)
ـ عصاره صاف شده 300 گرم خلال سيب‌زميني كه در يك ليتر آب تا يك ساعت جوشيده باشد.
ـ 10 گرم قند (گلوكز راست گرد) (قند دکستروز)
ـ 2 گرم مخمر (اختياري)
- 20 گرم آگار
ب) آگار MPG (مخلوط بذرـ پپتين ـ مالت)
ـ 20 گرم مالت عسلي رنگ
ـ 5 گرم پودر بذر چاودار
ـ 5 گرم پپتين يا نئوپپتن
ـ 2 گرم مخمر (اختياري)
ـ 20 گرم آگار
ج) آگار MEA (آگار عصاره مالت)
ـ 20 گرم مالت عسلي رنگ
ـ 2 گرم مخمر
ـ 20 گرم آگار
در تهيه محيط كشت، رعايت نكات زير ضروري است
1. pH محيط كشت: گونه‌هاي متفاوت قارچ براي رشد و نمو در محيط كشت، pH خاص خود را مي‌طلبند. بطوري كه pH مطلوب براي گونه‌هاي سيلوب 7-6 مي‌باشد؛ در حالي كه اين مقدار براي نوع دکمه‌اي 7-5/6 مي‌باشد. اكثر گونه‌ها، نسبتاً مقاوم بوده و بخوبي در دامنه 5/7 –5/5 رشد مي‌نمايند. pH كمتر از 5/4 و بالاتر از 7 باعث توقف رشد و نمو (هاگها و ميسليومها) مي‌گردد و چنانچه pH محيط خيلي پائين باشد. محيط كشت رقيق مي‌شود و بايد محيط تازه با pH مطلوب آماده شود. pH ، بعد از اتوكلاو كردن تا 4/0 واحد كاهش مي‌يابد.
چنانچه در حين تهيه محيط كشت، pH خيلي پائين يا بالا رود، مي‌توان بترتيب آن را با Naoh يا Hcl (1 تا 1/0 مولار) رقيق، تعديل كرده سپس محيط كشت را كاملاً هم زده و سپس pH آن را با يك pH سنج يا كاغذ تورنسل معمولي مي‌سنجيم ( pH يك مول Hcl ، صفر؛ يك مول Naoh =12 و يك مول آب مقطر= 7 است).
2.ضدعفوني محيط كشت: اين كار معمولاً به دو روش صورت مي‌گيرد.
الف: با مواد شيميائي: مانند الكل 70درصد؛ هيپوكلريت سديم (وايتكس) 1درصد و بالاخص آنتي‌بيوتيكها. در هر صورت ساده‌ترين راه، استفاده از مواد گياهي غير آلوده است. جهت كنترل باكتريها در محيط كشت، 1/0 گرم از محلول سولفات جنتامايسين 80-60درصد را قبل از عمل اتوكلاو كردن بايد به هر ليتر از اين محيط‌ها اضافه نمود. همچنين مي‌توان از نوع ديگر آنتي‌بيوتيك بنام استرپتومايسين بعد از استريل كردن محيط كشت استفاده كرد. در مجموع بايد از آنتي‌بيوتيكها بصورت موقتي و به مقدار بسيار اندك بهره جست چون غلظت بالاي آنها، مانع رشد و نمو بعضي گونه‌ها و از طرف ديگر ايجاد مقاومت در باكتريها مي‌شود.
ب) با بخار: بعد از اختلاط كامل تركيبات محيط كشت و در صورت باقي ماندن اثرات باكتري بعد از ضدعفونيِ شيميائي (آنتي‌بيوتيكها) مي‌توان براي رفع هر گونه آلودگي با بخار تحت فشار، محيط كشت را استريل و يا به اصطلاح اتوكلاو نمود. استريل كردن صحيح، بستگي به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استريل دارد. در شرايط عادي مي‌توان محيط كشت آماده را داخل ارلن پيركس (به علت دهانه تنگ آن ميزان تهويه، خشك شدن و ضريب آلودگي كاهش مي‌يابد) ريخته درب آن را با يك فويل آلومينيومي پوشاند. دقت كنيد كه حجم آگار درون ارلن نبايد از http://www.blogfa.com/Desktop/Image3.gif تا http://www.blogfa.com/Desktop/Image4.gif حجم كل ظرف بيشتر شود.
ظرف كشت را داخل اتوكلاو يا زودپز معمولي قرار داده و ته زودپز را يك سانتي‌متر آب مقطر بريزيد تا بخار لازم تأمين شود. طبق دستورالعمل شركت سازنده، درب زودپز را كاملاً بسته آن را حرارت دهيد تا بخار فراوان توليد نمايد. قبل از بستن سوپاپ اطمينان بخار، بگذاريد تا بخار آن به مدت 4 تا 5 دقيقه خارج شود. به آرامي فشار را به 15 پوند رسانده و 30 دقيقه در همين فشار نگهداريد. توجه كنيد دماي ظرف از 121 درجه سانتی گراد فراتر نرود، چه در غير اين صورت قند موجود در محيط كشت، سوخته و به اصطلاح كارامل مي‌شود كه در نتيجه آن؛ رشد ميسليوم متوقف شده، يكسري جهش‌هاي ناخواسته ژنتيكي پديدار مي‌شود. از طرفي اتوكلاو كردن بيش از 30 دقيقه باعث ته‌نشين شدن املاح مفيد (بخصوص k+ ) و تجزيه آگار مي‌شود. هم چنين بايد ظروف خالي شيشه‌اي و كاغذها را بطور جداگانه به مدت 30 دقيقه در دماي 130 سانتي‌گراد (بصورت خشك) استريل نمود.
نكته حائز اهميت ديگر در مورد اتوكلاو كردن، اين كه زمان لازم براي اين عمل بسته به ارتفاع از سطح دريا، متفاوت است. طبق قانون بويل ـ ماريوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقيمي با يكديگر دارند. فشار هوا را معمولاً نسبت به سطح استاندارد دريا محاسبه نموده و هر چه از سطح دريا بالاتر مي‌رويم فشار هوا كمتر مي‌شود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دريا، بايد فشار اتوكلاو يا زودپز را افزايش دهيم تا خللي در عمل استريليزاسيون وارد نشود. ذيلاً نسبت‌هاي بين پارامترهاي دما، فشار هوا، و تغييرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذيل مي‌بينيد. بعنوان مثال در ارتفاع حدوداً 1500 متري از سطح دريا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دريا تقريباً 5/4 -5 درجه سانتي‌گراد كاهش مي‌يابد (C˚95) و از طرفي در اين ارتفاع؛ فشار هوا 5 پوند يا تقريباً 4/0 اتمسفر نسبت به سطح دريا افزايش مي‌يابد (4/1 اتمسفر) در نتيجه با توجه با اين كه نبايد دماي داخل اتوكلاو را (به سبب بروز تغييرات شيميائي مواد داخل آن) افزايش دهيم، بناچار مجبوريم، فشار را به ميزان 4/0 آتمسفر (5 پوند) بالا ببريم تا جبران 5 اختلاف دما را در اين ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوكلاو بنمايد.
جدول1-2- رابطه بين ارتفاع و نقطه جوش و نيز فشار و دما
رابطه ارتفاع و نقطه جوش
رابطه فشار- دما در حجم ثابت
نقطه جوش
ارتفاع ازسطح دريا(متر)
فشارKg/cm2
(سانتی گراد) دما
100
در سطح دريا
07/0
100
99
307
2/0
104
98
619
3/0
108
97
5/934
7/0
115
96
1250
=1atm05/1
121
95
1567
5/1
126
93
1892
75/1
130
توجه كنيد استريليزاسيون در فشار 05/1 kg/cm2 به مدت يك ساعت داراي نتايج مشابهي با استريليزاسيون در فشار kg/cm22 به مدت 30 دقيقه (يعني دوبرابر كردن فشار و نصف كردن مدت زمان) دارد؛ منتها مسأله مهم در اين جا اين است كه اكثر زودپزها تحمل اين فشار را ندارند كه بايد حتماً قبل از استفاده به برچسب كنترل كيفي روي هر زودپز توجه شود.
بعد از اتمام استريل كردن؛ زودپز را در آزمايشگاه يا يك اطاق نيمه استريل قرار داده، اجازه دهيد تا قبل از باز كردن درب آن، فشار به يك پوند (07/0kg/cm2) كاهش يابد. سپس درب آن را باز نمائيد و اقدام به ريختن آگار در پتري ديش‌ها نمائيد. بايد دانست با هر ليتر از محلول آگار بدست آمده مي‌توان 30 پتري ديش 15×100 ميلي‌متر را پر نمود. چنانچه با محدوديت فضاي ميزكار مواجه هستيد، مي‌توانيد پتري ديش‌ها را پس از پر نمودن يك به يك روي هم بگذاريد اما در‌غير اين صورت مي‌توانيد هر يك از پتري ديش‌ها را در كنار هم قرار دهيد و دامنه كار خود را توسعه دهيد (شکل 22و23).
شكل 22 و 23- نحوه ريختن آگار در پتري ديش‌ها – سمت چپ: روش چیدن عمودی پتری دیشهای پر شده (ميز کار کوچک)؛ در سمت راست چیدن پتری دیشهای پر شده در کنار هم دیگر (ميز کار بزرگ).
پيش از پر نمودن پتري ديش‌ها، محلول كشت را به شدت تكان دهيد تا محتويات آن خوب پخش شده مخلوطي همگن بدست آيد. سپس بگذاريد تا آگار خنك شده و يكنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتري ديش‌ها نمائيد تا بدين وسيله از تعريق جدار داخلي ظروف كه از ريختن محلول آگار گرم ناشي مي‌شود، جلوگيري شود.
حال، اين محلول آماده كشت هاگ يا بافت زنده مي‌باشد كه در ادامه روش آنرا خواهيم ديد.
كشت هاگ
كشت خالص به منظور تهيه اسپان مورد نياز براي تكثير قارچ خوراكي را به دو روش مي‌توان تهيه نمود. كشت هاگ، كه به نوعي مي‌توان آن را تكثير جنسي ناميد و داراي تفريق صفات و تنوع بالاي نتاج حاصله از نظر كيفيت و كميت محصول مي‌باشد. از اين روش بيشتر براي تهيه بذر قارچ استفاده مي‌شود. روش دوم كشت بافت زنده يا به اصطلاح تكثير غيرجنسي و يا كلونينگ مي‌باشد. اين روش به علت شباهت بالاي نتاج توليدي با والدين؛ بيشتر در تكثير قارچ‌هائي كه از نظر كيفيت و كميت محصول در حد مطلوبي هستند استفاده مي‌شود.
پرورش دهندگان قارچ، كشت هاگ را بدليل راحتي اجرا و ماندگاري بالاي هاگها حتی تا ماهها بعد از تجزیه کلاهکها ترجيح مي‌دهند. اما ماندگاري كلاهكها يا بافت زنده بسيار كم است (1 تا 2 روز) و بايد بلافاصله بعد از چيدن بافت، اقدام به كشت نمود.
گرفتن نقش هاگ
مرحله اول در كشت هاگ؛ جمع‌آوري مقداری هاگ (نقش اسپور) از قارچ‌هاي سالم و مناسب مي‌باشد. بدين منظور كلاهك سالم، تازه و كاملاً تميزي را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روي يك كاغذ سفيد يا سطح شيشه‌اي تميز (اسلايد ميكروسكوپ) يك تا دو ساعت مي‌گذاريم. چنانچه كلاهك موردنظر خشك باشد، جهت رهاسازي آسانتر هاگ يكي دو قطره آب مقطر به آن زده و براي جلوگيري از كاهش تبخير و جريان هواي مستقيم، يك بشر بر روي آن مي‌گذاريم. پس از چند ساعت كه هاگها، كاملاً رها شد و نقش تيغه‌ها روي كاغذ افتاد؛ كاغذ هاگها را بريده از وسط تا مي‌زنيم و دريك ظرف كاملاً در بسته گذاشته وروي آن را بر چسبي حاوي زمان جمع‌آوري؛ گونه قارچ و شماره جمع‌آوري مي‌زنيم. در صورت جمع‌آوري هاگها روي لامل ميكروسكوپ، كافيست هاگها را ما بين دو لامل قرار داده دور تا دور لبه اين دو لامل را با نوار چسب بچسبانيم تا از نفوذ هاگهاي آلاينده، ايمن شود. در صورتي كه در جمع‌آوري و نگهداري هاگها دقت كافي نشود، محيط كشت هاگ آلوده شده و امكان به دست آوردن يك كشت خالص كاهش مي‌يابد. (شکل 24 الف)
شكل 24 الف- جمع آوري هاگها بر روي كاغذ سفيد تايپ (نقش هاگ).
شكل 24 ب- گرفتن نقش هاگ برروي پتري ديش و لامل ميکروسکوپ
http://alonefarmer.blogfa.com/post-1970.aspx