پیمان هادی فرکوش
24th May 2012, 11:42 PM
پروتئين های 14-3-3 خانواده ای از ملکولهای موجود در سلولها هستند که در مسيرهای تشخيصی پروتئين کينازی در تمام سلولهای يوکاريوتيک همکاری می کنند. پروتئين های 14-3-3 با عمل کردن بعنوان نقشه های اتصال فسفوسرين/فسفوترئونين در بر همکنش های وابسته به فسفريلاسيون بين پروتئين ها، کنترل پيشرفت چرخه سلولی، آغاز شدن و ادامه يافتن چک پوينت های آسيب DNA، فعال سازی MAPکيناز، جلوگيری از آپوپتوزيس و هماهنگ کردن سيگنالهای درونی و حرکت سيتواسکلتی ايفای نقش می کنند. با توجه به نقش پروتئين های 14-3-3 در بيماريهای انسانی بخصوص سرطان، در اين مقاله در مورد تنظيم ساختار 14-3-3 و اتصال آن به ليگاند بحث خواهيم کرد و آخرين اطلاعات در مورد نقش ايزوتيپ های مختلف 14-3-3، برهمکنش پروتئين های 14-3-3 با Raf، Cdc25 و اعضای متنوع اينتگرين ها و ويژگی هايی از پروتئين 14-3-3 که ممکن است در درمان بيماری های انسانی به عنوان هدف مورد استفاده قرار گيرند را به اطلاع می رسانيم.
پروتئين های 14-3-3 از جمله فراوانترين پروتئين های سلولی هستند که در سال 1967 بعنوان خانواده ای از پروتئين های اسيدی کشف شدند، اما نقش واقعی آنها تا 1995 ناشناخته بود . در اين زمان موسلين و همکارانش که روی فسفريلاسيون Raf و اتصال 14-3-3 مطالعه می کردند و نيز موريسون و همکارانش کشف کردند که پروتئين های 14-3-3 بطور اختصاصی به پپتيدهای حاوی فسفوسرين متصل می شوند، ازينرو پروتئين های 14-3-3 به عنوان بهترين مثال ملکول های اتصال فسفوسرين/ترئونين مطرح شدند. اين نکته که دمين های تشخيصی الگو قادرند به توالی های کوتاه حاوی فسفوتيروزين مثل دمين های SH2 و PT متصل شوند بخوبی درک شده بود اما تصور می شد که فسفريلاسيون پروتئين بدنبال اتصال سوبسترا به دمين های اتصال فسفری الگو برای فرمان دهی وقايعی که منحصرا بوسيله نوع خاصی از پروتئين کيناز واسطه گری می شوند انجام شده است. بر خلاف اين تصور می شد سيگنال دهی سلولی بوسيله سرين و ترئونين کيناز که حدود 92 درصد پروتئين کينازهای انسان را تشکيل می دهند بوسيله ساير مکانيسم ها مثل تغيير شکل فضايی بدليل فسفريلاسيون سوبسترا انجام شود که اين مطالب کاملا مورد تائيد است. بهرحال سلول های يوکاريوت دربردارنده همايش های متنوع دمين اتصالی فسفوسرين/ترئونين با پروتئين های14-3-3 است. اين دمين ها مثل خود پروتئين های 14-3-3 در کنترل تکثير سلولی در پاسخ سلول ها به آسيب DNA و همينطور هماهنگ کردن مکانيسم های ميتوزی نقشی حياتی ایفا می کنند.
اصطلاح 14-3-3 به خانواده ای از پروتئين های ديمری اسيدی که در تمام سلولهای يوکاريوتی تجلی پيدا می کنند اطلاق می شود. اين خانواده پروتئين های بسيار حفاظت شده شامل 7 ايزوتيپ مختلف در سلولهای انسان (β، γ، δ، ε، ζ، η، ι) می شود که نقشی حياتی در تنظيم پديده های سلولی مختلفی ازجمله بقای چک پوينت های چرخه سلولی و تعمير DNA، جلوگيری از آپوپتوزيس ، شروع تمايز، هماهنگی چسبندگی سلولی و حرکت سلولی بر عهده دارد. تمام پروتئين های 14-3-3 به موتيف های پپتيدی حاوی فسفوسرين/ترئونين که مسئول توالی های RSXpSXP يا RXXXpSXP هستند متصل می شوند. بسياری از پروتئين های اتصالی به 14-3-3 حاوی توالی هايی هستند که بشدت با اين موتيف ها جفت می شوند، اگرچه اتصال تعدادی از ليگاندها به 14-3-3 مستقل از فسفر و در حالتی اتفاق می افتد که توالی های آنها به اين موتيف ها شباهتی ندارد. اخيرا پوزلو و همکارانش برای تشخيص بيش از 200 نوع از ليگاندهای اتصالی به 14-3-3 از تکنولوژی کروماتوگرافی ميل ترکيبی و اسپکترومتری جرمی استفاده کرده اند، تمام اين ليگاندها توانائيشان را برای اتصال به 14-3-3 بر اثر دفسفريلاسيون با سرين/ترئونين فسفاتاز PP2A در محيط درشيشه از دست می دهند. برخی از پروتئين ها که به ستون تمايلی 14-3-3 متصل می شوند حاوی توالی هايی هستند که بشدت با موتيف های اتصالی مناسب جفت می شوند، درحاليکه بقيه عليرغم اتصال ويژه فسفری به 14-3-3 تنوع زيادی در توالی حفاظت شده نشان می دهند.
تصور می شود تمام پروتئين های 14-3-3 دارای ساختار سوم مشابهی باشند، ساختارهای ساخته شده از يک α هليکس برای هر منومر 14-3-3 که عملکرد بيولوژيک مشابه ديمر دارد و تا حدودی خم شده و ساختاری U شکل را ايجاد می نمايد. 4تا از اين αهليکس ها مستقيما در شکل گيری ديمر شرکت نموده در حاليکه سايرين ديوارهای کناری و سقف U را می سازند. اتصال 14-3-3 به موتيف های حاوی توالی های فسفوسرين/ترئونين حاوی برهمنکش های مستقيم بين فسفات با ليزين49 و آرژنين56 در هليکس αC و آرژنين 127 و تيروزين128 در هليکس αE است. در ساير ملکول های اسيدی اين زيرواحدها يک پاکت ابتدائی را شکل می دهند که مثالی از توانائی فسفريلاسيون سرين/ترئونين سوبسترا برای فعاليت به عنوان ليگاند اتصالی کنترل کننده تغييرات ملکولی است. وانگ و شاکس تمام توالی های 14-3-3 شناخته شده تا سال 1996 را مقايسه کرده و 5 بلوک حفاظت شده در خانواده 14-3-3ها را کشف کردند. اين مناطق حاوی هليکس های اتصال ليگاندی(αI، αC، αE و αG) می باشند که در منطقه انتهايی هليکس αA، لوپ اتصالی αA/αB و منطقه ابتدايی هليکس αB که قسمت های مهمی از ساختار ديمری را شکل می دهند وجود دارند. 14-3-3ها هرچند توالی حفاظت شده و ساختاری مشابه دارند اما بطور يکسانی به يک ليگاند بخصوص متصل نمی شوند. اگرچه تعداد اندکی از برهمکنش های ويژه ايزوتيپی برای اتصال بخوبی مشخص شده اند اما با توجه به اهميت بسيار زيستی آنها شايسته است تحقيقات بيشتری در اين خصوص انجام شود.
تعدادی از اعضا خانواده 14-3-3 ازجمله β و ζ می توانند به کنترل های پس ترجمه ای با فسفريلاسيون پاسخ دهند. آيتکن و همکارانش و نيز دوبيس و همکارانش معين کردند در سيستم های درشيشه و در مجود زنده پس از فسفرِلاسيون چندين مکان از پروتئين های 14-3-3 بعنوان هدفی برای کينازهای ابتدايی يا ساير کينازها هستند. مدل سازی ساختاری و تحقيقات تجربی مستقيم با استفاده از Raf اين نظريه را مطرح می کند که فسفريلاسيون اين محل ها می تواند توانائی اتصال فسفری 14-3-3 را تغيير دهد. ابسيلوا و همکارانش گزارش نمودند که فسفريلاسيون تيروزين 233 در 14-3-3ζ با کازئين کيناز Ι سبب تغيير کنفورميشنی در C ترمينال و در نتيجه کاهش اتصال ليگاندی وابسته به فسفر و سرکوب فعاليت سروتونين N استيل ترانسفراز 14-3-3 تحريک شده در محيط درشيشه می شود. پاول و همکارانش کشف کردند که در سيستم درشيشه MAPKAP کيناز 2 می تواند با 14-3-3ζ در سرين58 برهمکنش داشته و البته آنرا فسفريله نمايد . بررسی مدل رايانه ای در تحقيقاتی که با استفاده از موتان 14-3-3 S58D انجام شد اثر فسفريلاسيون در توانائی ديمری شدن 14-3-3 را تائيد کرد.
در سری آزمايشات مهمی شان و همکارانش نشان دادند که تنظيم 14-3-3 بواسطه فسفريلاسيون در شکل منومری بيش ازشکل ديمری انجام می شود. علاوه براين آنها اتصال فرم ديمری(شکل وحشی) و منومری(جهش يافته) پروتئين های 14-3-3 به پروتئين های اندوژن فسفريله و غيرفسفريله را در سلول های COS-7 و HEK با استفاده از آنتی بادی برعليه يکی از موتيف های اتصالی فسفری 14-3-3 (RSXpSXP) و عصاره های پروتئين های مارکدار شده [35]-S مطالعه کردند. هرچند بسياری از پروتئين های مارکدارشده [35]-S به شکل مو.تان GST (منومری) 14-3-3 متصل هستند اين برهمکنش مستقل از فسغر است، در حاليکه فقط پروتئين هايی که به GST- 14-3-3 ديمری(شکل وحشی) متصل می شوند بوسيله آنتی بادی ويژه موتيف 14-3-3 شناسايی می شوند. از اين نتايج می توان چنين استنباط نمود که مهار القاشده فسفريلاسيون ديمری شدن 14-3-3 مستقيما زير مجموعه ليگاندهای اتصالی در محيط زنده را تغيير می دهد و بطور غيرمستقيم اتصال ليگاندها به پروتئين های 14-3-3 باقی مانده را با کاهش مقدار ایزوتيپ های مشخص 14-3-3 در مخزن ديمری تحت تاثير قرار می دهد.
مکانيسم ديگر تنظيم کمپلکس ليگاند:14-3-3 تنظيم ترجمه خانواده 14-3-3 است. منطقه پروموتر و قطعات ´5 ترجمه نشده ايزوفرم های متفاوت 14-3-3 متنوع است که مستلزم وجود مکانيسم های تنظيم ترجمه ای متفاوتی است. آيتکن نشان داد که ايزوفرم های 14-3-3 در ويژگی های خود برای همو و هتروديمری شدن متفاوتند. ازينرو هتروديمرهای متفاوت احتمالا به ليگاندهای هدف متفاوتی متصل شده و يا به يک ليگاند هدف مشابه اما با ميل ترکيبی متفاوت متصل می شوند، اين تغييرات در تجلی ايزوفرم های ويژه 14-3-3به احتمال زياد به تغييرات مفصل بلندتری در سيگنال دهی سلولی می انجامد. بعلاوه تجلی سطح بالای يک ايزوفرم احتمالا تجلی ايزوفرم ديگری را متوقف کرده و از ديمر شدن آن با ايزوتيپ کمتر شايع سوم جلوگيری می نمايد، اين پديده را تداخل ايزوتيپی می نامند. برای فهم ارتباطات مجزای هتروديمر ها و نيز تداخل ايزوتيپی در سيگنال دهی وابسته به 14-3-3 مطالعات وسيعتری لازم است.
طبيعت ديمری پروتئين 14-3-3 به آن اجازه اتصال همزمان به بيش از يک مکان روی ليگاند هدف را می دهد. يک مدل برای عمل 14-3-3 شامل اتصال يک باقيمانده نگهبان دروازه غالب است که محل های دومی با ميل ترکيبی کمتر برای 14-3-3 فراهم می آورد. دراين مسير احتمالا ساختار پايدار 14-3-3 بعنوان ملکولی سندانی شکل برای تثبيت شکل فضايی ليگاندهای متصل عمل می کند. اين کنفورميشن های اتصالی 14-3-3 می تواند فعاليت کاتاليتيکی پروتئين متصل به آن (Raf ، استيل سروتونين ترانسفراز، Chk1 و Wee1 ) را افزايش دهد و پروتئين های فسفريله شده (Cdc25c و NUDEL) را جداکرده و یا ساير وقايع فسفريلاسيون ديگر (BAD) را تسهيل می نمايد. علاوه بر اين اتصال 14-3-3 احتمالا توالی های هدف سلول را پوشانده يا از بين می برد، در نتيجه تغيير در صادرات و واردات هسته يا ساير اندامک ها با تداخل ملکولی بوجود می آيد.
نکته جالب آنست که هرچند پروتئين های 14-3-3 در تمام سلولهای يوکاريوت ازجمله گياهان، مخمر و پروتئوزوآها تجلی می يابند اما يک جد پروکاريوتی مشخص معلوم نيست. عليرغم همولژی زياد توالی ها و ساختار سوم پروتئين های 14-3-3 مسيرهايی که اين پروتئين ها در آن عمل می کنند بطور قابل توجهی متنوع است. از اين نکته می توان نتيجه گرفت که تکامل يوکاريوتيک ترکيبات سيگنال دهی جديد و مسيرهای متنوعی را برای کسب سود از عملکرد 14-3-3 بوجود آورده تنوع تعداد ايزوفرم های 14-3-3 در موجودات عالی تر لزوم وجود تنظيم مناسب برهمکنش ها برای کسب عملکردهای مجزا در شبکه کمپلکس سيگنال دهی را خاطر نشان می سازد. تغيير برخی از اين پيچيدگی ها و ويژگی های ايزوفرم ها در سيگنال دهی 14-3-3 در گزارشات اخير بيماری های انسانی تائيد شده است.
تغييرات تجلی بسياری از پروتئين های 14-3-3 با چندين سرطان انسانی مرتبط است. تنظيم کاهشی 14-3-3δ با تعدادی از سرطانهای اپيتليالی انسان مرتبط است. ورکوتر- ادوارت (Vercoutter-Edouart) و همکارانشان نشاندادند که 14-3-3δ براحتی در ژل دوبعدی رنگ آميزی شده با کماسی از سلولهای اپيتليالی نرمال سينه قابل تشخيص است ، اما در نمونه پروتئين های سرطان سينه که پس از هضم تريپسين بوسيله MALDI-TOF و MS/MS تيمار شده اند قابل تشخيص نيستند. فرگوسن ( Ferguson) و همکارانش نيز از طريق آناليز SAGE معلوم کردند که سطح RNA پيامبر 14-3-3δ در 45 مورد از 48 کارسينومای ابتدائی سينه تا سطوح بسيار پائين کاهش می يابد و بررسی های بيشتر مشخص نمود که در اين سلولها بشدت هيپرمتيلاسيون اتفاق افتاده بطوری که در 75 مورد از 82 کارسينومای سينه مورد بررسی در جزاير CpG مکان ژنی (لوکوس) 14-3-3δ هيپرمتيلاسيون شديد رخ داده و سبب خاموشی ژن مذکور می گردد. علاوه براين ، کشت اين سلولها با 5آزا 2́ داکسی سيتيدين سبب می شود متيلاسيون زايی در ژن انجام شده و سنتز 14-3-3δ mRNA افزايش يابد. آمبريخت (Umbricht) و همکارانش گزارش کردند که در بيماران با سرطان سينه ناحيه پروموتور 14-3-3δ حتی در بافت نرمال احاطه کننده مجاور تومور ( منطقه سرطانی ) هيپرمتيله شده اند. اين اطللاعات در حاليکه هيچکدام از بافت های کنترلی افراد نرمال اين پديده را نشان نداده اند بيانگر آنست که خاموشی ژن 14-3-3δ به احتمال زياد واقعه ای زود در سرطانزايی سينه است .
اخيرا" اورانو (Urano) و همکارانش مکانيسمی ديگر را تشخيص دادند که بواسطه آن سلولهای سرطان سينه سطح پروتئين 14-3-3δ را کاهش می دهند، دراين حالت اين سلولها از طريق تنظيم افزايشی پروتئين Efp ( نوعی ليگاز اوبی کوئيتينی وابسته به انگشت حلقه ای موسوم به E3 ) که 14-3-3δ را بوسيله پروتئوزوم از بين ميبرد عمل می کنند. زمانی که سلولهای MCF7 که با Efp آنتی سنس کشت شده بودند به موش های آتيميک پيوند شوند در مقدار 14-3-3δ افزايش نشانداده و سبب کاهش اندازه تومور می شوند. از آنجايی که موارد مشابه تنظيم کاهشی 14-3-3δ در کارسينومای ريه، نئوپلازی فرج فلسی شکل، کارسينومای مثانه، کارسينومای سلولهای جگر، کارسينوماهای دهانی و کارسينوما های سلول های فلسی شکل سر وگردن ديده می شود نقشی عمومی برای 14-3-3δ بعنوان ژن مهارکننده تومور محتمل بنظر می آيد.
با توجه به داده هايی که از آزمايشات منظم در لابراتوار وگلستين (Vogelstein) بدست آمده اينگونه بنظر می آيد که در سلولهای اپيتليالی 14-3-3δ نقش مهمی را در پديده تقويت چک پوينت G2/M پس از آسيب DNA برعهده دارد. هرم کينگ (Hermeking) و همکارانش اعلام کردند که 14-3-3δ پاسخ اصلی ژن p53 در سلولهای HCT116 است که در معرض عوامل مخرب DNA قرار گرفته اند و نقش حفظ چک پوينت G2/M را برای 14-3-3δ در نظر گرفتند. و اين در حالی بود تصور می شد 14-3-3δ با تجزيه کردن Cdc25C در چک پوينت G2/M دخالت دارد. بهر حال 14-3-3δ نقشی منحصربفرد در اين پديده دارد هرچند که اکنون مشخص گرديده برهمکنشی با Cdc25C ندارد.
چان(Chan) و همکارانش نشان دادند در سلولهای HCT116 همولوگ و نوترکيب که 14-3-3δ هدف قرارگرفته، 14-3-3δ نقشی اساسی در برقراری چک پوينت G2/M پس ازقرار گرفتن در معرض آدرياميسين (adriamycin) ايفا می نمايد. سلولهای ابتدايی 14-3-3δ-/-HCT116 که فاقد توانايی برقراری چک پوينت G2/M می باشند پس از قرار گرفتن در معرض آدرياميسين مرگ سلولی پس از آن را تجربه می نمايند که اين واقعه فاجعه ميتوزی خوانده می شود. چان و همکارانش اعلام کردند که سلولهای 14-3-3δ-/-HCT116 قادر نيستند در سيتو پلاسمی که با آدرياميسين تيمار شده Cdc2/cyclin B1 را تجزيه کرده و اين پديده سبب می شود منجر به افزايش چک پوينت G2/M می شود. بر همکنش بين 14-3-3δ و Cdc2 در چندين بقررسی ديگر نيز گزارش شده است، اما بسياری از سئوالات با توجه به وسعتی که اين برهمکنش وابسته به صدمه DNA ونيز مدوله شدن آن بوسيله سيگنال سلولی دارد باقی مانده است.
بسياری ازمنابع تاکيد می کنند که فعال شدن p53 پس از صدمه DNA مستقيما سطح 14-3-3δ را افزوده و اين افزايش تنظيم شده برای برقراری چک پوينت G2/M ضروری است. بر همکنش بين p53 و 14-3-3 پيچيده است و بنظر می آيد که حداقل تا حدودی وابسته به نوع سلول باشد. بعنوان مثال 14-3-3δ و ساير ايزوتيپ های 14-3-3 احتمالا مستقيما به خود p53 متصل شده که سبب می شود عمل اتصال به DNA و فعاليت p53 بعنوان يک فاکتور رونويسی زياد شود. وترمن(Waterman) و همکارانش گزارش کرده اند که اين برهمکنش ها در سلولهای قرارگرفته در معرض عوامل آسيب رسان به DNA بين محل نامناسبی از بايندينگ سايت 14-3-3 به p53 یعنی (Ser-378) بود و منجر به ديفسفوريلاسيون همزمان Ser-378 برای ساخت بايندينگ سايت 14-3-3 می شد. استارويدی(Stavridi) و همکارانش گزارش کردند که در سلولهای موتان p53 که قادر به اتصال 14-3-3 به Ser-378 نيستند فعاليت رونويسی کمتر از حالت عادی است. علاوه بر اين اين نويسندگان اعلام کردند که در سلولهای غير اپيتليالی در زمان صدمه DNA ايزوفرم های ε ، γ و τ بيش از 14-3-3δ با p53 برهمکنش دارند. در حاليکه اکثر پروتئين های 14-3-3 در بسياری از انواع سلولها بيان می شوند، 14-3-3δ اصولا در سلولهای اپيتليالی بيان می شوند. بعدا يانگ(Yang) و همکارانش توانستند برهمکنش های وابسته به صدمه DNA بين 14-3-3δ و p53 را در سلولهای اپيتليالی ريه انسان کشف کنند. همانطدر که انتظار می رفت برهمکنش بين 14-3-3δ و p53 سبب پايداری p53 و افزايش فعاليت رونويسی آن می شود. بطور کلی سطح عمومی MDM2 (ليگاز E3 اوبی کوئيتينی که بر p53 اثر تنظيمی منفی دارد) زمانی که سطح 14-3-3δ افزايش يابد دچار کاهش می گردد. عليرغم اهميت p53 در بيان 14-3-3δ سلولهای اپيتليالی p53-/- سطح بيان پايه 14-3-3δ را حفظ می نمايند. در اين مورد p63 ( وشايد p73) نيز می توانند به پروموتر سيگما متصل شوند که يادآور وجود اشکال مختلفی از تنظيم می شود. وبر (Weber) و همکارانش نشان دادند که سلولهای p53-/-HCT116 هنوز پروتئين 14-3-3δ را در حد پايه بيان می کنند، و سطح آن احتمالا در پاسخ به قرارگرفتن در معرض آدرياميسين (همانند سلولهای طبيعی HCT116) افزايش می يابد. بر عکس چان و همکارانش اعلام کردند که در سلول های HCT116 با قرار گرفتن در معرض آدرياميسين سطح پروتئين 14-3-3δ در سلول بشدت افزايش می يابد. در سلولهای اپيتليالی در غياب فعاليت تحريکی 14-3-3δ بر فعاليت p53 نيز شاهد فعاليت p53 در کنترل چک پوينت خواهيم بود که نشاندهنده چند مقصدی بودن p53 است. مثلا درحاليکه سلولهای p53-/-HCT116 نمی توانند سطح p21 را بيافزايند سلولهای HCT116 14-3-3δ-/- دارای اين توانايی هستند، و اين بيانگر انست که تنظيم رونويسی p21 توسط p53 کاملا وابسته به حضور 14-3-3δ نيست. دو لورنزی(De Laurenzi) و همکارانش نشان دادند که p63 وp73 می توانند در تنظيم سطح p21 از طريق تنظيم رونويسی نقش داشته باشند، اما بهرحال نقش دقيق آنها در وقايع صدمه DNA هنوز نا مشخص باقی مانده است. از آنجايی که تحقيقات بونز(Bunz) و همکارانش و چان و همکارانش نشان داد که سلولهای p53-/- ، سلولهای 14-3-3δ-/- و سلولهای p21-/- همگی قادرند چک پوينت G2/M را آغاز کنند(البته قادر به حفظ آن نيستند) لذا بنظر می رسد 14-3-3δ و p21 در مسيرهای موازی ای که برای بقای توقفG2/M عمل می کنند، هردو p53 را مورد هدف قرار می دهند.
پروتئين های 14-3-3 از جمله فراوانترين پروتئين های سلولی هستند که در سال 1967 بعنوان خانواده ای از پروتئين های اسيدی کشف شدند، اما نقش واقعی آنها تا 1995 ناشناخته بود . در اين زمان موسلين و همکارانش که روی فسفريلاسيون Raf و اتصال 14-3-3 مطالعه می کردند و نيز موريسون و همکارانش کشف کردند که پروتئين های 14-3-3 بطور اختصاصی به پپتيدهای حاوی فسفوسرين متصل می شوند، ازينرو پروتئين های 14-3-3 به عنوان بهترين مثال ملکول های اتصال فسفوسرين/ترئونين مطرح شدند. اين نکته که دمين های تشخيصی الگو قادرند به توالی های کوتاه حاوی فسفوتيروزين مثل دمين های SH2 و PT متصل شوند بخوبی درک شده بود اما تصور می شد که فسفريلاسيون پروتئين بدنبال اتصال سوبسترا به دمين های اتصال فسفری الگو برای فرمان دهی وقايعی که منحصرا بوسيله نوع خاصی از پروتئين کيناز واسطه گری می شوند انجام شده است. بر خلاف اين تصور می شد سيگنال دهی سلولی بوسيله سرين و ترئونين کيناز که حدود 92 درصد پروتئين کينازهای انسان را تشکيل می دهند بوسيله ساير مکانيسم ها مثل تغيير شکل فضايی بدليل فسفريلاسيون سوبسترا انجام شود که اين مطالب کاملا مورد تائيد است. بهرحال سلول های يوکاريوت دربردارنده همايش های متنوع دمين اتصالی فسفوسرين/ترئونين با پروتئين های14-3-3 است. اين دمين ها مثل خود پروتئين های 14-3-3 در کنترل تکثير سلولی در پاسخ سلول ها به آسيب DNA و همينطور هماهنگ کردن مکانيسم های ميتوزی نقشی حياتی ایفا می کنند.
اصطلاح 14-3-3 به خانواده ای از پروتئين های ديمری اسيدی که در تمام سلولهای يوکاريوتی تجلی پيدا می کنند اطلاق می شود. اين خانواده پروتئين های بسيار حفاظت شده شامل 7 ايزوتيپ مختلف در سلولهای انسان (β، γ، δ، ε، ζ، η، ι) می شود که نقشی حياتی در تنظيم پديده های سلولی مختلفی ازجمله بقای چک پوينت های چرخه سلولی و تعمير DNA، جلوگيری از آپوپتوزيس ، شروع تمايز، هماهنگی چسبندگی سلولی و حرکت سلولی بر عهده دارد. تمام پروتئين های 14-3-3 به موتيف های پپتيدی حاوی فسفوسرين/ترئونين که مسئول توالی های RSXpSXP يا RXXXpSXP هستند متصل می شوند. بسياری از پروتئين های اتصالی به 14-3-3 حاوی توالی هايی هستند که بشدت با اين موتيف ها جفت می شوند، اگرچه اتصال تعدادی از ليگاندها به 14-3-3 مستقل از فسفر و در حالتی اتفاق می افتد که توالی های آنها به اين موتيف ها شباهتی ندارد. اخيرا پوزلو و همکارانش برای تشخيص بيش از 200 نوع از ليگاندهای اتصالی به 14-3-3 از تکنولوژی کروماتوگرافی ميل ترکيبی و اسپکترومتری جرمی استفاده کرده اند، تمام اين ليگاندها توانائيشان را برای اتصال به 14-3-3 بر اثر دفسفريلاسيون با سرين/ترئونين فسفاتاز PP2A در محيط درشيشه از دست می دهند. برخی از پروتئين ها که به ستون تمايلی 14-3-3 متصل می شوند حاوی توالی هايی هستند که بشدت با موتيف های اتصالی مناسب جفت می شوند، درحاليکه بقيه عليرغم اتصال ويژه فسفری به 14-3-3 تنوع زيادی در توالی حفاظت شده نشان می دهند.
تصور می شود تمام پروتئين های 14-3-3 دارای ساختار سوم مشابهی باشند، ساختارهای ساخته شده از يک α هليکس برای هر منومر 14-3-3 که عملکرد بيولوژيک مشابه ديمر دارد و تا حدودی خم شده و ساختاری U شکل را ايجاد می نمايد. 4تا از اين αهليکس ها مستقيما در شکل گيری ديمر شرکت نموده در حاليکه سايرين ديوارهای کناری و سقف U را می سازند. اتصال 14-3-3 به موتيف های حاوی توالی های فسفوسرين/ترئونين حاوی برهمنکش های مستقيم بين فسفات با ليزين49 و آرژنين56 در هليکس αC و آرژنين 127 و تيروزين128 در هليکس αE است. در ساير ملکول های اسيدی اين زيرواحدها يک پاکت ابتدائی را شکل می دهند که مثالی از توانائی فسفريلاسيون سرين/ترئونين سوبسترا برای فعاليت به عنوان ليگاند اتصالی کنترل کننده تغييرات ملکولی است. وانگ و شاکس تمام توالی های 14-3-3 شناخته شده تا سال 1996 را مقايسه کرده و 5 بلوک حفاظت شده در خانواده 14-3-3ها را کشف کردند. اين مناطق حاوی هليکس های اتصال ليگاندی(αI، αC، αE و αG) می باشند که در منطقه انتهايی هليکس αA، لوپ اتصالی αA/αB و منطقه ابتدايی هليکس αB که قسمت های مهمی از ساختار ديمری را شکل می دهند وجود دارند. 14-3-3ها هرچند توالی حفاظت شده و ساختاری مشابه دارند اما بطور يکسانی به يک ليگاند بخصوص متصل نمی شوند. اگرچه تعداد اندکی از برهمکنش های ويژه ايزوتيپی برای اتصال بخوبی مشخص شده اند اما با توجه به اهميت بسيار زيستی آنها شايسته است تحقيقات بيشتری در اين خصوص انجام شود.
تعدادی از اعضا خانواده 14-3-3 ازجمله β و ζ می توانند به کنترل های پس ترجمه ای با فسفريلاسيون پاسخ دهند. آيتکن و همکارانش و نيز دوبيس و همکارانش معين کردند در سيستم های درشيشه و در مجود زنده پس از فسفرِلاسيون چندين مکان از پروتئين های 14-3-3 بعنوان هدفی برای کينازهای ابتدايی يا ساير کينازها هستند. مدل سازی ساختاری و تحقيقات تجربی مستقيم با استفاده از Raf اين نظريه را مطرح می کند که فسفريلاسيون اين محل ها می تواند توانائی اتصال فسفری 14-3-3 را تغيير دهد. ابسيلوا و همکارانش گزارش نمودند که فسفريلاسيون تيروزين 233 در 14-3-3ζ با کازئين کيناز Ι سبب تغيير کنفورميشنی در C ترمينال و در نتيجه کاهش اتصال ليگاندی وابسته به فسفر و سرکوب فعاليت سروتونين N استيل ترانسفراز 14-3-3 تحريک شده در محيط درشيشه می شود. پاول و همکارانش کشف کردند که در سيستم درشيشه MAPKAP کيناز 2 می تواند با 14-3-3ζ در سرين58 برهمکنش داشته و البته آنرا فسفريله نمايد . بررسی مدل رايانه ای در تحقيقاتی که با استفاده از موتان 14-3-3 S58D انجام شد اثر فسفريلاسيون در توانائی ديمری شدن 14-3-3 را تائيد کرد.
در سری آزمايشات مهمی شان و همکارانش نشان دادند که تنظيم 14-3-3 بواسطه فسفريلاسيون در شکل منومری بيش ازشکل ديمری انجام می شود. علاوه براين آنها اتصال فرم ديمری(شکل وحشی) و منومری(جهش يافته) پروتئين های 14-3-3 به پروتئين های اندوژن فسفريله و غيرفسفريله را در سلول های COS-7 و HEK با استفاده از آنتی بادی برعليه يکی از موتيف های اتصالی فسفری 14-3-3 (RSXpSXP) و عصاره های پروتئين های مارکدار شده [35]-S مطالعه کردند. هرچند بسياری از پروتئين های مارکدارشده [35]-S به شکل مو.تان GST (منومری) 14-3-3 متصل هستند اين برهمکنش مستقل از فسغر است، در حاليکه فقط پروتئين هايی که به GST- 14-3-3 ديمری(شکل وحشی) متصل می شوند بوسيله آنتی بادی ويژه موتيف 14-3-3 شناسايی می شوند. از اين نتايج می توان چنين استنباط نمود که مهار القاشده فسفريلاسيون ديمری شدن 14-3-3 مستقيما زير مجموعه ليگاندهای اتصالی در محيط زنده را تغيير می دهد و بطور غيرمستقيم اتصال ليگاندها به پروتئين های 14-3-3 باقی مانده را با کاهش مقدار ایزوتيپ های مشخص 14-3-3 در مخزن ديمری تحت تاثير قرار می دهد.
مکانيسم ديگر تنظيم کمپلکس ليگاند:14-3-3 تنظيم ترجمه خانواده 14-3-3 است. منطقه پروموتر و قطعات ´5 ترجمه نشده ايزوفرم های متفاوت 14-3-3 متنوع است که مستلزم وجود مکانيسم های تنظيم ترجمه ای متفاوتی است. آيتکن نشان داد که ايزوفرم های 14-3-3 در ويژگی های خود برای همو و هتروديمری شدن متفاوتند. ازينرو هتروديمرهای متفاوت احتمالا به ليگاندهای هدف متفاوتی متصل شده و يا به يک ليگاند هدف مشابه اما با ميل ترکيبی متفاوت متصل می شوند، اين تغييرات در تجلی ايزوفرم های ويژه 14-3-3به احتمال زياد به تغييرات مفصل بلندتری در سيگنال دهی سلولی می انجامد. بعلاوه تجلی سطح بالای يک ايزوفرم احتمالا تجلی ايزوفرم ديگری را متوقف کرده و از ديمر شدن آن با ايزوتيپ کمتر شايع سوم جلوگيری می نمايد، اين پديده را تداخل ايزوتيپی می نامند. برای فهم ارتباطات مجزای هتروديمر ها و نيز تداخل ايزوتيپی در سيگنال دهی وابسته به 14-3-3 مطالعات وسيعتری لازم است.
طبيعت ديمری پروتئين 14-3-3 به آن اجازه اتصال همزمان به بيش از يک مکان روی ليگاند هدف را می دهد. يک مدل برای عمل 14-3-3 شامل اتصال يک باقيمانده نگهبان دروازه غالب است که محل های دومی با ميل ترکيبی کمتر برای 14-3-3 فراهم می آورد. دراين مسير احتمالا ساختار پايدار 14-3-3 بعنوان ملکولی سندانی شکل برای تثبيت شکل فضايی ليگاندهای متصل عمل می کند. اين کنفورميشن های اتصالی 14-3-3 می تواند فعاليت کاتاليتيکی پروتئين متصل به آن (Raf ، استيل سروتونين ترانسفراز، Chk1 و Wee1 ) را افزايش دهد و پروتئين های فسفريله شده (Cdc25c و NUDEL) را جداکرده و یا ساير وقايع فسفريلاسيون ديگر (BAD) را تسهيل می نمايد. علاوه بر اين اتصال 14-3-3 احتمالا توالی های هدف سلول را پوشانده يا از بين می برد، در نتيجه تغيير در صادرات و واردات هسته يا ساير اندامک ها با تداخل ملکولی بوجود می آيد.
نکته جالب آنست که هرچند پروتئين های 14-3-3 در تمام سلولهای يوکاريوت ازجمله گياهان، مخمر و پروتئوزوآها تجلی می يابند اما يک جد پروکاريوتی مشخص معلوم نيست. عليرغم همولژی زياد توالی ها و ساختار سوم پروتئين های 14-3-3 مسيرهايی که اين پروتئين ها در آن عمل می کنند بطور قابل توجهی متنوع است. از اين نکته می توان نتيجه گرفت که تکامل يوکاريوتيک ترکيبات سيگنال دهی جديد و مسيرهای متنوعی را برای کسب سود از عملکرد 14-3-3 بوجود آورده تنوع تعداد ايزوفرم های 14-3-3 در موجودات عالی تر لزوم وجود تنظيم مناسب برهمکنش ها برای کسب عملکردهای مجزا در شبکه کمپلکس سيگنال دهی را خاطر نشان می سازد. تغيير برخی از اين پيچيدگی ها و ويژگی های ايزوفرم ها در سيگنال دهی 14-3-3 در گزارشات اخير بيماری های انسانی تائيد شده است.
تغييرات تجلی بسياری از پروتئين های 14-3-3 با چندين سرطان انسانی مرتبط است. تنظيم کاهشی 14-3-3δ با تعدادی از سرطانهای اپيتليالی انسان مرتبط است. ورکوتر- ادوارت (Vercoutter-Edouart) و همکارانشان نشاندادند که 14-3-3δ براحتی در ژل دوبعدی رنگ آميزی شده با کماسی از سلولهای اپيتليالی نرمال سينه قابل تشخيص است ، اما در نمونه پروتئين های سرطان سينه که پس از هضم تريپسين بوسيله MALDI-TOF و MS/MS تيمار شده اند قابل تشخيص نيستند. فرگوسن ( Ferguson) و همکارانش نيز از طريق آناليز SAGE معلوم کردند که سطح RNA پيامبر 14-3-3δ در 45 مورد از 48 کارسينومای ابتدائی سينه تا سطوح بسيار پائين کاهش می يابد و بررسی های بيشتر مشخص نمود که در اين سلولها بشدت هيپرمتيلاسيون اتفاق افتاده بطوری که در 75 مورد از 82 کارسينومای سينه مورد بررسی در جزاير CpG مکان ژنی (لوکوس) 14-3-3δ هيپرمتيلاسيون شديد رخ داده و سبب خاموشی ژن مذکور می گردد. علاوه براين ، کشت اين سلولها با 5آزا 2́ داکسی سيتيدين سبب می شود متيلاسيون زايی در ژن انجام شده و سنتز 14-3-3δ mRNA افزايش يابد. آمبريخت (Umbricht) و همکارانش گزارش کردند که در بيماران با سرطان سينه ناحيه پروموتور 14-3-3δ حتی در بافت نرمال احاطه کننده مجاور تومور ( منطقه سرطانی ) هيپرمتيله شده اند. اين اطللاعات در حاليکه هيچکدام از بافت های کنترلی افراد نرمال اين پديده را نشان نداده اند بيانگر آنست که خاموشی ژن 14-3-3δ به احتمال زياد واقعه ای زود در سرطانزايی سينه است .
اخيرا" اورانو (Urano) و همکارانش مکانيسمی ديگر را تشخيص دادند که بواسطه آن سلولهای سرطان سينه سطح پروتئين 14-3-3δ را کاهش می دهند، دراين حالت اين سلولها از طريق تنظيم افزايشی پروتئين Efp ( نوعی ليگاز اوبی کوئيتينی وابسته به انگشت حلقه ای موسوم به E3 ) که 14-3-3δ را بوسيله پروتئوزوم از بين ميبرد عمل می کنند. زمانی که سلولهای MCF7 که با Efp آنتی سنس کشت شده بودند به موش های آتيميک پيوند شوند در مقدار 14-3-3δ افزايش نشانداده و سبب کاهش اندازه تومور می شوند. از آنجايی که موارد مشابه تنظيم کاهشی 14-3-3δ در کارسينومای ريه، نئوپلازی فرج فلسی شکل، کارسينومای مثانه، کارسينومای سلولهای جگر، کارسينوماهای دهانی و کارسينوما های سلول های فلسی شکل سر وگردن ديده می شود نقشی عمومی برای 14-3-3δ بعنوان ژن مهارکننده تومور محتمل بنظر می آيد.
با توجه به داده هايی که از آزمايشات منظم در لابراتوار وگلستين (Vogelstein) بدست آمده اينگونه بنظر می آيد که در سلولهای اپيتليالی 14-3-3δ نقش مهمی را در پديده تقويت چک پوينت G2/M پس از آسيب DNA برعهده دارد. هرم کينگ (Hermeking) و همکارانش اعلام کردند که 14-3-3δ پاسخ اصلی ژن p53 در سلولهای HCT116 است که در معرض عوامل مخرب DNA قرار گرفته اند و نقش حفظ چک پوينت G2/M را برای 14-3-3δ در نظر گرفتند. و اين در حالی بود تصور می شد 14-3-3δ با تجزيه کردن Cdc25C در چک پوينت G2/M دخالت دارد. بهر حال 14-3-3δ نقشی منحصربفرد در اين پديده دارد هرچند که اکنون مشخص گرديده برهمکنشی با Cdc25C ندارد.
چان(Chan) و همکارانش نشان دادند در سلولهای HCT116 همولوگ و نوترکيب که 14-3-3δ هدف قرارگرفته، 14-3-3δ نقشی اساسی در برقراری چک پوينت G2/M پس ازقرار گرفتن در معرض آدرياميسين (adriamycin) ايفا می نمايد. سلولهای ابتدايی 14-3-3δ-/-HCT116 که فاقد توانايی برقراری چک پوينت G2/M می باشند پس از قرار گرفتن در معرض آدرياميسين مرگ سلولی پس از آن را تجربه می نمايند که اين واقعه فاجعه ميتوزی خوانده می شود. چان و همکارانش اعلام کردند که سلولهای 14-3-3δ-/-HCT116 قادر نيستند در سيتو پلاسمی که با آدرياميسين تيمار شده Cdc2/cyclin B1 را تجزيه کرده و اين پديده سبب می شود منجر به افزايش چک پوينت G2/M می شود. بر همکنش بين 14-3-3δ و Cdc2 در چندين بقررسی ديگر نيز گزارش شده است، اما بسياری از سئوالات با توجه به وسعتی که اين برهمکنش وابسته به صدمه DNA ونيز مدوله شدن آن بوسيله سيگنال سلولی دارد باقی مانده است.
بسياری ازمنابع تاکيد می کنند که فعال شدن p53 پس از صدمه DNA مستقيما سطح 14-3-3δ را افزوده و اين افزايش تنظيم شده برای برقراری چک پوينت G2/M ضروری است. بر همکنش بين p53 و 14-3-3 پيچيده است و بنظر می آيد که حداقل تا حدودی وابسته به نوع سلول باشد. بعنوان مثال 14-3-3δ و ساير ايزوتيپ های 14-3-3 احتمالا مستقيما به خود p53 متصل شده که سبب می شود عمل اتصال به DNA و فعاليت p53 بعنوان يک فاکتور رونويسی زياد شود. وترمن(Waterman) و همکارانش گزارش کرده اند که اين برهمکنش ها در سلولهای قرارگرفته در معرض عوامل آسيب رسان به DNA بين محل نامناسبی از بايندينگ سايت 14-3-3 به p53 یعنی (Ser-378) بود و منجر به ديفسفوريلاسيون همزمان Ser-378 برای ساخت بايندينگ سايت 14-3-3 می شد. استارويدی(Stavridi) و همکارانش گزارش کردند که در سلولهای موتان p53 که قادر به اتصال 14-3-3 به Ser-378 نيستند فعاليت رونويسی کمتر از حالت عادی است. علاوه بر اين اين نويسندگان اعلام کردند که در سلولهای غير اپيتليالی در زمان صدمه DNA ايزوفرم های ε ، γ و τ بيش از 14-3-3δ با p53 برهمکنش دارند. در حاليکه اکثر پروتئين های 14-3-3 در بسياری از انواع سلولها بيان می شوند، 14-3-3δ اصولا در سلولهای اپيتليالی بيان می شوند. بعدا يانگ(Yang) و همکارانش توانستند برهمکنش های وابسته به صدمه DNA بين 14-3-3δ و p53 را در سلولهای اپيتليالی ريه انسان کشف کنند. همانطدر که انتظار می رفت برهمکنش بين 14-3-3δ و p53 سبب پايداری p53 و افزايش فعاليت رونويسی آن می شود. بطور کلی سطح عمومی MDM2 (ليگاز E3 اوبی کوئيتينی که بر p53 اثر تنظيمی منفی دارد) زمانی که سطح 14-3-3δ افزايش يابد دچار کاهش می گردد. عليرغم اهميت p53 در بيان 14-3-3δ سلولهای اپيتليالی p53-/- سطح بيان پايه 14-3-3δ را حفظ می نمايند. در اين مورد p63 ( وشايد p73) نيز می توانند به پروموتر سيگما متصل شوند که يادآور وجود اشکال مختلفی از تنظيم می شود. وبر (Weber) و همکارانش نشان دادند که سلولهای p53-/-HCT116 هنوز پروتئين 14-3-3δ را در حد پايه بيان می کنند، و سطح آن احتمالا در پاسخ به قرارگرفتن در معرض آدرياميسين (همانند سلولهای طبيعی HCT116) افزايش می يابد. بر عکس چان و همکارانش اعلام کردند که در سلول های HCT116 با قرار گرفتن در معرض آدرياميسين سطح پروتئين 14-3-3δ در سلول بشدت افزايش می يابد. در سلولهای اپيتليالی در غياب فعاليت تحريکی 14-3-3δ بر فعاليت p53 نيز شاهد فعاليت p53 در کنترل چک پوينت خواهيم بود که نشاندهنده چند مقصدی بودن p53 است. مثلا درحاليکه سلولهای p53-/-HCT116 نمی توانند سطح p21 را بيافزايند سلولهای HCT116 14-3-3δ-/- دارای اين توانايی هستند، و اين بيانگر انست که تنظيم رونويسی p21 توسط p53 کاملا وابسته به حضور 14-3-3δ نيست. دو لورنزی(De Laurenzi) و همکارانش نشان دادند که p63 وp73 می توانند در تنظيم سطح p21 از طريق تنظيم رونويسی نقش داشته باشند، اما بهرحال نقش دقيق آنها در وقايع صدمه DNA هنوز نا مشخص باقی مانده است. از آنجايی که تحقيقات بونز(Bunz) و همکارانش و چان و همکارانش نشان داد که سلولهای p53-/- ، سلولهای 14-3-3δ-/- و سلولهای p21-/- همگی قادرند چک پوينت G2/M را آغاز کنند(البته قادر به حفظ آن نيستند) لذا بنظر می رسد 14-3-3δ و p21 در مسيرهای موازی ای که برای بقای توقفG2/M عمل می کنند، هردو p53 را مورد هدف قرار می دهند.